金钗石斛内生细菌的分离及抑菌活性研究

摘要

植物内生菌长期生活在一种适宜又特殊的植物微生态系统中，行使着多种生物学功能，如促进宿主植物生长、增强宿主植物抗性、促进宿主植物次生代谢产物的产生等。更为重要的是某些药用植物的药用成分也能通过其内生菌获得。因此，药用植物内生菌及其次生代谢产物已经成为目前研究者们寻求新型天然药物的焦点。 金钗石斛（Dendrobium nobile）是一种名贵中药材，富含多糖、生物碱、萜等多种活性成分，具抗癌、抗菌、抗氧化、治疗白内障等多种药理作用。本文将对金钗石斛的内生细菌及放线菌进行分离培养，分析其体内可培养内生细菌和放线菌的多样性，筛选具有抑菌活性的菌株，并对拮抗内生菌产生的抑菌活性成分进行初步分析。具体结果如下： 1. 采用传统分离培养法，从金钗石斛根、茎、叶中共分离获得1081株内生细菌和145株内生放线菌。经过对分离菌株16S rRNA基因序列分析，1081株内生细菌分别隶属于厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门(Proteobacteria)中的12个属。其中厚壁菌门包括芽孢杆菌属（Bacillus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、短杆菌属（Brevibacillus）、赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus）、柯恩氏菌属（Cohnella）、芽孢八叠球菌属（Sporosarcina）和Fictibacillus等7个属；变形菌门包括伯克氏菌属（Burkholderia）、副伯克氏菌属（Paraburkholderia） 、泛菌属（Pantoea）、Dyella和藤黄杆菌属（Luteibacter）等5个属。其中Bacillus为优势菌群。145株内生放线菌分别隶属于链霉菌属（Streptomyces）、小单孢菌属（Micromonospora）、诺卡氏菌属（Nocardia）和拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）等4个属，其中Streptomyces为优势菌属。根内生细菌的Shannon-Wiener多样性指数（2.20）和Margalef丰富度指数（5.81）均最高，叶内生细菌的Shannon-Eveness均匀度指数（0.69）最高；根内生放线菌的Shannon-Wiener多样性指数（2.55）最高，叶内生放线菌的Shannon-Eveness均匀度指数（0.99）最高，茎内生放线菌的Margalef丰富度指数（4.08）最高。 2. 采用双层平板打孔法和对峙培养法，以大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、白菜软腐病菌（Escherichia carotorora）、猕猴桃溃疡病菌（Pseudomonas syringae pv.actinidae ）、水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）、白色念珠菌（Candida albicans）、瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）、水稻纹枯菌（Rhizoctorzia solani）和棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum）等为指示菌。筛选获得具抑菌活性的菌株共73株，其中62株为细菌，11株为放线菌，分别隶属于Bacillus、Paenibacillus、Dyella、Brevibacillus等细菌和Streptomyces放线菌。其中Bacillus和Streptomyces具有广谱抑菌活性。 3. 通过石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次对拮抗内生细菌发酵上清液进行萃取，薄层层析法、TLC-生物活性追踪法和薄层显色法对抑菌活性成分进行初步分析。结果表明，金钗石斛内生细菌产生的抑菌活性成分主要分为3类，其中包括两类生物碱类。

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1.3 石斛属植物内生菌及其生物活性研究概况

1.4 研究目的及意义

1.5 研究路线

2.1.1 实验样品及来源

2.2.1 金钗石斛内生细菌和放线菌的分离及鉴定

2.2.2 分离菌株抑菌活性的筛选

2.2.3 金钗石斛拮抗内生细菌抑菌成分分析

3.1.1 内生细菌及放线菌的分离

3.1.2 分离菌株16S rDNA序列扩增产物的ARDRA分析

3.1.3 金钗石斛内生菌的鉴定及系统发育分析

5.1.5 金钗石斛内生菌抑菌活性的筛选

5.1.6 抑菌活性内生菌的鉴定

5.1.7 金钗石斛内生细菌抑菌活性成分的初步分离和鉴定

5.1.8 金钗石斛内生细菌抑菌活性成分的多样性

参考文献

附 录 (培养基配方)

致 谢