金银花蛀干害虫咖啡脊虎天牛嗅觉相关基因鉴定及表达谱分析

摘要

金银花Lonicera japonicaThunb为忍冬科Caprifoliaceae多年生常绿藤本植物，其花是我国传统常用中药。咖啡脊虎天牛（Xylotrechus grayii White）是金银花的蛀干害虫，隐蔽危害，利用化学农药对其防治效果不明显且严重影响药材安全性，急需开发无公害的防治手段。在长期进化过程中，昆虫形成高度灵敏和复杂的嗅觉系统，用其感受并识别外界环境中的化学信息物质，完成寄主植物、配偶的搜寻和定位。昆虫嗅觉信号的形成涉及气味结合蛋白（odorant-binding proteins，OBPs）和化学感受蛋白（chemosensory protein，CSPs）等一系列相关蛋白的互作，阐明昆虫对环境中挥发性化合物的感受机制，为利用化学信息素对害虫进行迷向、引诱等可持续控制提供理论依据。本文通过测定咖啡脊虎天牛成虫触角转录组，利用生物信息学方法鉴定嗅觉相关蛋白基因，并分析化学感受蛋白基因CSPs在不同组织的表达差异，初步揭示咖啡脊虎天牛的嗅觉感受机制，为该天牛科学防治提供理论依据。主要取得如下研究结果： 1、咖啡脊虎天牛触角转录组测序及生物信息学分析： （1）咖啡脊虎天牛触角转录组测序共获得102,535,456条原始序列，去除杂质后获得98,460,094条Clean reads，Q30碱基百分比均不小于90%，GC含量均在44%左右。通过无参考基因组从头组装后，经Trinity拼接得到127824条转录本（Transcripts），最终筛选得到90490条unigenes，其中长度在1000bp以上的有15281条，平均长度为710nt，N50长度为1416nt。 （2）对所获得的90490条unigenes进行功能注释，其中20651条unigenes注释到NR数据库，6648条unigenes注释到KOG数据库，10292条unigenes注释到KEGG数据库，16248条unigenes注释到GO数据库。 2、咖啡脊虎天牛嗅觉基因的鉴定： 利用生物信息学方法分析转录组数据，鉴定得到34个气味结合蛋白（OBPs）基因，15个化学感受蛋白（CSPs）基因，60个气味受体（ORs）基因，4个感觉神经元膜蛋白（SNMPs）基因。将咖啡脊虎天牛嗅觉相关基因与其他昆虫的嗅觉相关基因构建系统发育树，比较各嗅觉相关基因与其他昆虫嗅觉相关基因的进化关系。 3、咖啡脊虎天牛4个化学感受蛋白表达谱分析： 利用荧光定量PCR（qRT-PCR）技术研究4个化学感受蛋白基因在咖啡脊虎天牛雌、雄成虫触角（At）、头（H）、胸（C）、腹（Ab）、足（F）的表达情况，结果表明：XgraCSP2在雌雄虫触角、头、足中高表达，且XgraCSP2在雄虫腹中的表达量高于雌虫；在胸中基本不表达。XgraCSP4在雌虫触角的表达量最高，其次在头的表达量较高，在腹中有微量表达，触角中的表达量与头中的表达量存在显著性差异，触角的表达量是头的2倍；XgraCSP4在雄虫头中高表达，其次在触角、胸中表达，在腹、足中有微量表达；雌虫与雄虫相比XgraCSP4在触角的表达量高于雄虫，但是在头中的表达量低于雄虫。XgraCSP5在雌虫各组织中有微量表达，主要在雄虫触角中高表达，在雄虫头、胸、腹、足中有微量表达。XgraCSP9主要在触角中高表达，且雌虫与雄虫之间存在显著性差异，雌虫表达量是雄虫2.5倍，在其他组织中基本不表达。

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摘 要

ABSTRACT

1 文献综述

1.1 金银花药用价值

1.2 金银花常见害虫

1.3 咖啡脊虎天牛研究现状

1.3.1 形态特征

1.3.2 生物学习性

1.3.3 危害及发生规律

1.4 昆虫嗅觉感受机制

1.4.1 昆虫嗅觉感器

1.4.2 昆虫对信息化学物质的识别

1.5 嗅觉相关蛋白研究概况

1.5.1 昆虫气味结合蛋白研究进展

1.5.1.1 气味结合蛋白的特征

1.5.1.2 气味结合蛋白的功能研究

1.5.2 昆虫化学感受蛋白研究进展

1.5.3 昆虫气味受体研究进展

1.5.4 昆虫感觉神经元膜蛋白研究进展

1.6 研究目的与意义

1.7 研究内容

1.8 技术路线

2 咖啡脊虎天牛触角转录组分析

2.1 材料与方法

2.1.2.1 主要仪器

2.1.2.2 主要试剂

2.1.3 咖啡脊虎天牛总RNA的提取

2.1.3.1咖啡脊虎天牛总RNA的提取步骤

2.2 转录组测序

2.3 生物信息分析流程

2.3.1 测序数据过滤

2.3.2 Unigene的功能注释

2.4 结果与分析

2.4.1 咖啡脊虎天牛总RNA提取质量

2.4.2 测序及组装结果

2.4.3 Unigene功能注释与KOG分类

2.4.4 Nr注释

2.4.5 GO注释

2.4.6 KOG注释

2.4.7 KEGG注释

2.5 讨论

3 咖啡脊虎天牛嗅觉相关基因鉴定

3.1 实验方法

3.1.1 咖啡脊虎天牛嗅觉相关基因鉴定

3.1.2 OBP基因鉴定

3.1.3 CSP基因鉴定

3.1.4 ORs、SNMPs基因鉴定

3.2 序列分析

3.3 构建系统发育树

3.4 结果与分析

3.4.1 咖啡脊虎天牛嗅觉相关蛋白序列分析

3.4.1.1气味结合蛋白序列分析

3.4.1.2 咖啡脊虎天牛化学感受蛋白分析

3.4.1.3 咖啡脊虎天牛气味受体蛋白分析

3.4.1.3 咖啡脊虎天牛感觉神经元膜蛋白序列分析

3.4.2 构建咖啡脊虎天牛嗅觉相关蛋白系统发育树

3.4.2.1 气味结合蛋白OBP系统发育树

3.4.2.2 化学感受蛋白CSP系统发育树

3.4.2.3气味受体蛋白ORs系统发育树

3.4.2.4 感觉神经元膜蛋白SNMP系统发育树

3.5 讨论

4 咖啡脊虎天牛化学感受基因组织表达模式研究

4.1 材料与方法

4.1.1 实验材料

4.1.2 主要仪器

4.1.3 主要试剂

4.1.4 总RNA提取

4.1.5 cDNA第一链合成

4.1.6 qRT-PCR引物设计

4.1.7 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）反应

4.2 结果分析

4.2.1 qRT-PCR结果

4.3 讨论

5 结论与展望

参考文献

攻读硕士研究生期间发表的学术论文

致 谢