基于液质联用技术的HIV/AIDS脾肺气虚证与湿热内蕴证患者尿液的代谢组学研究

摘要

目的：代谢组学是一门新兴科学,已广泛应用于医学领域,它通过运用质谱(MS)、色谱、核磁共振(NMR)等现代仪器检测分析手段,定性或定量研究观察生物样本中所有可检测的代谢产物的综合表现,探讨生物体对外源性物质以及遗传变异的应答等所引起的病理生理变化反应,将这些变化反应与代谢信息中的生物学相关事件联系起来,以检测活细胞中的化学变化及其生物学意义。艾滋病是因感染人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)而引起的慢性致死性传染病,在世界范围内已呈现明显的上升趋势,其对社会产生的影响已经成为全球高度重视的重大公共卫生问题和社会问题。通过运用代谢组学的研究方法,寻找爱滋病患者尿液中的特异代谢产物,及爱滋病中医不同证型间的差异物质,为中医辨证施治和中医诊断的量化建立新的手段,为中医药在诊断和防治艾滋病进展中的作用提供先进的技术支持。
　　方法：本研究选取具有代表性的艾滋病基本证候中脾肺气虚证和湿热内蕴证患者作为研究对象,病例来源于河南省的艾滋病患者,西医诊断标准采用国家卫生部2005年推荐《艾滋病诊疗指南》诊断标准。中医诊断标准目前尚无国家标准或行业标准,本项目采用前期课题成果 “HIV/AIDS 常见证候诊断量表”中符合脾肺气虚证和湿热内蕴证的标准。
　　实验方法：实验初期先做正常人预实验以确定实验的具体方法和条件参数。收集本研究入组对象晨尿2ml作为受试样品,放于-20℃保存一周转移至-80℃冰箱备用。
　　尿样前期处理：尿液处理前,先在室温下解冻,移取1ml尿液,4000r/min高速离心10min,取上清液。精密移取上清液300μL,置1.5ml离心管中,加入600μL甲醇,用混匀器混匀约10min,然后高速离心10min,14000r/min,4℃控温,取上清液800μL,用0.45μm滤膜过滤,即得供试品溶液。
　　液相色谱条件 色谱柱为Agilent Zorbax C18 (150×2.1mm,3.1μm)；流动相：0.2%冰醋酸水-甲醇梯度洗脱(见附表 2)；流速：0.2ml/min；进样盘温度：4℃；进样量：20μL；柱温：30℃；色谱图采集时间不少于60min。
　　质谱条件 扫描方式：一级全扫描,鞘气流速：40 bar, 辅助气流速：10 bar,喷雾电压：4kv,毛细管电压：-4v,毛细管温度：300℃,质荷比范围：80-1000,采用负离子扫描模式。
　　经上样前处理后,运用液质联用技术(HPLC-MS)分析尿液成分,经质谱分析仪器自带软件导出原始数据(质荷比对应的峰强度)Excel文件,对数据进行筛选,筛选原则为：每个证型中相同质荷比(数据上下浮动在±1 的定义为同一类物质)。采用SPSS13.0软件和SIMCA-P软件对数据进行T检验分析、聚类分析、PCA模式识别分析处理。
　　结果：数据经T检验分析,结果显示： P值<0.05有显著的统计学意义。根据T检验结果、聚类分析结果、PCA 分析结果可以看出运用代谢组学的方法可以很好的将正常组和艾滋病病人组及艾滋病病人肺脾气虚证和湿热内蕴证组间进行很好的鉴别,两组之间存在着显著的差异性。综合T检验和相应的plot图中可以看到在正常组与艾滋病病人组中质荷比为794、412、505、213、368、118、618、388、159、101、109、210、192、124 的物质存在显著的差异；在正常组和艾滋病脾肺气虚证组中质荷比为 412、794、505、118、329、352、388、618、562、502、560、159、384、109、101、117、125、339的物质存在显著的差异；在正常组和艾滋病湿热内蕴组中质荷比为412、794、368、157、125、109、210、124、192、182的物质存在显著的差异；在艾滋病脾肺气虚证组和艾滋病湿热内蕴证组中质荷比为521、331、376、121、338、151的物质存在显著的差异。
　　结论：
　　1.艾滋病病人和正常人尿液代谢轮廓均有良好的区分。
　　2.发现了一些可能存在的潜在标志物,如质荷比为794、412、388、118的物质,有助于艾滋病临床微观指标的诊断,对其量化有一定的作用。
　　3.代谢组学的研究方法有望成为诊断及判别艾滋病中医证型的新手段。

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前言

实验方法与步骤

1研究对象

2材料和样品前期处理方法

3实验条件的筛选和确立

4 液相色谱-质谱条件

5 液质联用分析方法学考察

6代谢组学分析

实验结果

1 研究对象的一般资料分析

2T检验结果

3聚类分析结果

4 主成分分析结果

5综合分析

讨论

1理论探讨

2 结果分析：

结论

致谢

参考文献

附录

附件1：附图

附件2：附表

附件3：文献综述

附件4：在校发表论文及科研情况