黔北麻羊MHC-DR亚区基因多态性与免疫性状相关性研究

摘要

为探索黔北麻羊MHC-DR亚区基因多态性及其与免疫性状相关性，本研究以4-6月龄黔北麻羊为研究对象，采用直接测序技术筛选出MHC-DR亚区基因各外显子的SNPs位点，并与免疫性状指标进行相关性分析，得到与免疫性状指标有显著效应的分子遗传标记，进一步找出具有这些遗传标记的黔北麻羊，追踪其至成年时，显著性低组（A组）的和显著性高组（B组）的黔北麻羊各3只进行宰杀，取其心、肝、脾、肺、肾、胰、颌下淋巴、颌下腺、颈下淋巴和胸腺共10种组织样本，提取各组织的RNA进行实时荧光定量PCR试验，观察两组黔北麻羊MHC-DR亚区基因在组织中的表达差异，以期为黔北麻羊抗病育种的辅助选择提供科学依据。
　　1.黔北麻羊MHC-DR亚区基因SNPs位点的筛出
　　通过直接测序技术对黔北麻羊MHC-DR亚区基因各外显子进行SNPs位点的筛选，最终筛选出67个多态位点。DRA基因未筛出多态位点；DRB1基因Exon3共筛出8个，分别是A8858G(Thr→Ala)、C8859T、G8969A(Gly→Ser)、C8974T、G8989A、G9094T(Glu→Asp)、C9100T和G9124A，共计3个错义突变位点；DRB2基因共筛出14个，其中在 Exon3中筛选出5个，分别是 G13286T、C13405T(Pro→Leu)、G13406A、A13469G、T13481C，在Exon4中筛选出9个，分别是A15573G(Ile→Val)、C15574T(Thr→Ile)、G15636A(Val→Met)、A15642G、G15753A(Val→Met)、G15779C(Gln→His)、G15780A(Gly→Ser)、C15797T、C15831A(Leu→Ile），共计8个错义突变位点；DRB3基因共筛出45个，其中在 Exon2中筛选出34个，分别是 A8925C(Lys→Thr)、C8929A(Ser→Arg)、A8937G(His→Arg)、 C8953G， C8966T(Leu→Phe)、 T8984C(Tyr→His)、T8999A(Tyr→Asn)、A9000T(Tyr→Phe)、T9009A(Phe→Tyr)、T9030A、G9037A、G9041A(Ala→Thr)、G9059A(Ser→Gly)、A9060G(Ser→Asn）、C9061T、A9065G(Lys→Glu）、C9088G(Glu→Asp)、C9091T， A9099G(Asp→Gly)、C9100G(Asp→Glu）、G9103C(Arg→Ser)、C9104A，A9107G(Thr→Ala)、G9110T、C9111A(Ala→Glu)、G9112C(Glu→Asp)、C9120A(Thr→Lys)、T9122G(Tyr→Asp)、A9123T(Tyr→Phe)、C9124G、C9131T(His→Tyr)、T9147G，A9158G(Tyr→Ala）、C9159G(Tyr→Ser）、在Exon3中筛选出11个，分别是A11244G(Tyr→Ala)、G11262A(Ala→Tyr)、A11264G、T11312C、A11315T、G11355A(Gly→Ser)、C11360T， G11450C(Gln→His)、A11451G(Ser→His)、T11480G(Asp→Glu)、C11486T，共计31个错义突变位点。
　　2.遗传特性分析及抗原表位预测
　　在对所筛位点进行遗传特性分析后得到黔北麻羊MHC-DR亚区基因外显子的多态信息含量（PIC）多处于0.25-0.5之间，属于中度多态，表示多数SNPs能比较合理地提供遗传信息；对突变位点的杂合度分析得到，除DRB3基因第3外显子突变位点的杂合度在0.25左右以外，其余突变位点的杂合度多出现在0.5左右，表明该黔北麻羊存在一定程度的遗传变异；对各突变位点的优势等位基因分析发现各位点多以野生型（与参考序列相同的纯合基因型）为优势等位基因；连锁不平衡分析未发现完全连锁现象。利用在线抗原表位预测软件预测黔北麻羊MHC-DR亚区各基因多态位点引起的抗原表位的改变。结果发现，DRB1基因的A8858G位点，DRB2基因的G15779C、C15831A位点，DRB3基因A8937G、A11244G位点的突变都引起抗原表位的氨基酸残基位数的改变。
　　3.黔北麻羊MHC-DR亚区基因多态性与免疫指标相关性分析
　　将黔北麻羊MHC-DR亚区基因筛出的67个多态位点与免疫指标进行相关性分析后得到与免疫性状显著相关的位点有26个，极显著相关的有14个。在黔北麻羊MHC-DR亚区基因与血常规指标的相关性分析中发现：各突变位点与3种以上血常规指标显著相关及极显著相关的位点有DRB1 Exon3的A8858G， DRB2 Exon4的A15573G和G15636A，DRB3 Exon2的A8937G，DRB3 Exon3的T11480G；各突变位点与2种血常规指标显著相关及极显著相关的位点有DRB2 Exon3的G13286T和T13481C，DRB3 Exon2的G9059A和G9112C；各位点与2种主要免疫指标极显著相关的位点有DRB3 Exon3 A11244G（P＜0.01）， G11262A（P＜0.01）和A11451G（P＜0.01）；各位点与1种主要免疫指标显著相关及极显著相关的位点有DRB1 Exon3的G8989A，DRB2 Exon3的T13481C，DRB2 Exon4的G15636A和G15780A，DRB3 Exon2的A8937G，G9059A，C9100G和G9103C；DRB3 Exon3A11315T，G11450C和T11480G；各位点与血常规指标和主要免疫指标均呈显著相关及极显著相关的位点有DRB2 Exon3的T13481C， DRB2 Exon4的G15636A，DRB3 Exon2的A8937G和G9059A，DRB3 Exon3的A11451G和T11480G。
　　4.黔北麻羊MHC-DR亚区基因表达规律研究
　　通过实时荧光定量PCR分析黔北麻羊MHC-DR亚区基因在心、肝、肺、肾以及免疫组织中的表达差异，结果发现各基因在组织中均有表达，且普遍表现出在免疫组织中的表达量较高。DRA、DRB2和DRB3基因在显著性低组（A组）的和显著性高组（B组）中脾脏组织表达量都是最高，且B组的DRA、DRB2和DRB3基因在免疫组织中的表达量均有明显增加；DRB1基因在A、B两组中表达差异较不明显；由此可以看出，本研究筛选出的黔北麻羊MHC-DR亚区基因在免疫组织中的表达量普遍较高，初步验证其对黔北麻羊的免疫性状具有有效性，属于具显著相关的遗传标记。
　　综上，黔北麻羊MHC-DR亚区基因属于中度多态，未发现连锁完全不平衡现象；筛出的67个多态位点与免疫性状显著相关的位点有26个，极显著相关的有14个；黔北麻羊MHC-DR亚区基因在免疫组织中的表达量普遍表较高；本研究在黔北麻羊MHC-DR亚区基因中筛选出与免疫性状显著相关的重要分子遗传标记位点有：DRB2 Exon4的G15636A，DRB3 Exon2的A8937G，G9059A， DRB3 Exon3的A11244G，A11451G和T11480G，可作为黔北麻羊乃至其它山羊抗病育种的遗传标记。

目录

第一章 文献综述

1.1黔北麻羊基本情况

1.2 MHC基因概述

1.3 MHC基因的结构和功能

1.4 羊MHC基因多态性的研究进展

1.5 MHC基因在抗病育种中的研究进展

1.6研究的目的及意义

第二章 黔北麻羊MHC-DR亚区基因多态性的检测及分析

2.1 试验材料

2.2 试验方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

第三章 黔北麻羊MHC-DR亚区基因多态性与免疫性状相关性分析

3.1 试验材料

3.2 试验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

第四章 黔北麻羊MHC-DR亚区基因的表达规律研究

4.1 试验材料

4.2 试验方法

4.3 试验结果与分析

4.5讨论

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

5.3 创新点

致谢

参考文献

附录

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