犬细小病毒病临床诊疗及主要病毒基因的克隆与表达

摘要

目的
　　犬细小病毒（canine parvovirus，CPV）病自发现以来一直是危害犬类健康的最严重的传染病之一，尤其对2～6月龄的幼犬危害最大，临床上多表现为吐逆、拉稀及出血性肠炎为主。随着病毒的不断变异，给此病的治疗以及预防带来了新的挑战。本研究以在2015年9月～2016年9月间，贵阳某动物医院收治的患犬细小病毒病病犬为研究对象，通过对患病犬的临床诊断与治疗，总结出目前贵阳地区治疗犬细小病毒病的最佳方式，以提高治愈率。对病毒进行分离鉴定、序列分析及其原核表达，为探究病毒的变异情况，了解贵阳市流行基因型以及对未来新疫苗的研发提供一定数据。
　　方法
　　根据宠物医院门诊收治的病犬，首先对病犬进行临床初诊，在进行胶体金试纸的确诊，畜主对治疗方法的要求，对患犬细小病毒病的病犬进行不同方式治疗，分为对症支持治疗组、特异性治疗组以及综合治疗组。对每组治疗的病犬进行用药分析，对比三种不同治疗方法，总结出对犬细小病毒病的治疗的最佳用药方法。
　　随机择取患病犬20只，搜集粪便拭子，采取同步接种法，将经过处理的病料上清液接种 F81细胞，进行病毒的分离培养；对成功分离的病毒进行血凝及血凝抑制试验进行初步鉴定，再对所分离的病毒进行病毒的PCR鉴定，根据GenBank上传的犬细小病毒全基因组序列，设计两对特异性引物，分别扩增VP1基因与VP2基因；对扩增的VP1与VP2基因进行TA克隆并测序，对测序结果进行分析。
　　分别将VP1与VP2基因亚克隆到pET-32a载体上，进行原核表达载体的构建，构建成功后转化 BL21（DE3）感受态细胞，加入 IPTG进行诱导表达，对诱导表达进行温度与浓度的优化，得到VP1与VP2蛋白的最优表达条件。对诱导的VP1与VP2蛋白进行Western Blot试验，验证VP1与VP2蛋白的免疫原性。
　　结果
　　1.通过临床症状对43只患病犬进行初诊，再进行胶体金试纸确诊37只，准确率达到86%；本试验对37只患犬细小病毒的病犬根据其畜主要求而分为用三种不同治疗方法，其中对症支持治疗组治愈率最低，为14.3%，治愈率最高的为综合治疗组，为84.6%，特异性治疗组次之，为50%。
　　2.对接种F81细胞的20只病犬病料，成功分离出10株犬细小病毒，这10株分离株均能使F81细胞产生変圆、聚集、脱落等细胞病变；对10株分离的病毒进行血凝及血凝抑制试验，血凝试验病毒效价均在1∶25以上，血凝抑制试验表明，犬细小病毒单克隆抗体能很好的中和分离的病毒；对10株分离株进行PCR鉴定，均能在预期目的条带位置出现明显条带。
　　3.对10株分离株的VP1与VP2基因进行序列分析，所分离的VP1基因与国内外16株参考株的核苷酸同源性在98.6%~100%，且亲缘关系与国内分离株较近，与国外分离株较远。对VP2基因分析，此次分离的10株分离株中，7株为CPV-2a亚型，3株为CPV-2c亚型；VP2基因与国内外30株参考株核苷酸同源性在97.7%~99.9%，亲缘关系与国内分离株较近，与国外分离株较远，且10株分离株与疫苗株亲缘关系较远。
　　4.对VP1与VP2蛋白进行诱导表达，VP1蛋白在37℃，IPTG浓度大于1 mM时，获得最佳表达量；VP2蛋白在37℃，IPTG浓度为2 mM时获得最佳表达量。用His标签通过Western Blot均能检测到所表达的VP1与VP2蛋白。

目录

缩略语

第一章 文献综述

1.1 犬细小病毒病原学

1.2犬细小病毒的起源与进化

1.3 犬细小病毒流行病学

1.4 临床症状与致病机理

1.5 病理变化

1.6 犬细小病毒病的诊断

1.7 犬细小病毒的防治

1.8 研究背景与目的意义

第二章 贵阳地区犬细小病毒病的临床诊疗分析

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果

2.4 讨论

第三章 贵阳地区犬细小病毒的分离鉴定及遗传进化分析

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果与分析

3.3 讨 论

第四章 犬细小病毒VP1与VP2基因的原核表达

4.1 材料

4.2 方法

4.3 结果

4.4 讨论

第五章 全文结论

参考文献

附录

致谢

声明