携带遗传标记的PCV1-2嵌合病毒感染性克隆质粒的构建

摘要

猪圆环病毒2型（ Porcine circovirus type2, PCV2）属于圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus），是一种单股负链环状的DNA病毒。PCV2能引起母猪繁殖障碍、断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、猪呼吸道综合征和 PCV2相关性肠炎等多种疾病，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。目前，疫苗免疫仍是防控PCV2的主要手段，我国市面上的疫苗主要是灭活疫苗，该类疫苗对PCV2的防控起到了重要作用。但是，目前的灭活疫苗也存在诸如不能有效的诱导宿主产生细胞免疫，其产生的抗体不能同野毒相区别等缺陷。iDNA疫苗作为一种新型基因工程疫苗，其既能发挥核酸疫苗的作用，又能发挥弱毒疫苗的作用，能同时诱导体液免疫和细胞免疫，具有良好的发展前景。鉴于此，本研究通过基因工程技术构建了携带遗传标记的PCV1-2嵌合病毒感染性克隆质粒，拯救获得了携带遗传标记的重组病毒株，并对其进行了初步鉴定，为研发PCV2 iDNA标记疫苗奠定了基础，主要研究内容如下：
　　1、PCV2贵州分离株各基因型之间的差异及生物信息学分析
　　本研究首先对PCV2贵州分离株各基因型之间的差异及生物信息学进行了分析，旨在掌握贵州省PCV2流行毒株的分子遗传特征，为构建携带遗传标记的PCV1-2嵌合病毒亲本毒株基因型的选择和PCV2的防控提供参考。构建进化树显示，当前贵州流行株主要为PCV2b和PCV2d基因型毒株。通过对收集的51株PCV2核苷酸序列的比较分析发现，PCV2各基因型毒株的全基因组大小分别为PCV2a（1768 bp）、PCV2b（1767 bp）、PCV2c（1767bp）、PCV2d（1767 bp）、PCV2e（1768bp），ORF2基因组大小分别为PCV2a（702 bp）、PCV2b（702 bp）、PCV2c（705bp）、PCV2d（705bp）、PCV2e（702 bp），根据他们基因组的差异可以将PCV2a/PCV2e、PCV2b、PCV2c/PCV2d进行区分；各PCV2毒株核苷酸序列之间的差异主要存在于ORF2和ORF1内，同种基因型毒株之间的氨基酸序列较为保守，不同基因型毒株之间的氨基酸序列差异较大，其中PCV2a同PCV2d毒株之间的差异最大，PCV2b型毒株与另外2种基因型毒株之间的差异稍小， 推测PCV2b可能是PCV2a向PCV2d演化的一种过渡基因型毒株；从序列相似性来看，PCV2b型毒株是研发PCV2 iDNA疫苗的良好候选疫苗毒株。
　　2、PCV1-2m-V5嵌合病毒感染性克隆质粒的构建及初步鉴定
　　根据序列分析的结果，本研究选择PCV2b型的GZ-RH1株作为亲本毒株，通过设计1对含V5标签的引物，应用PCR技术将V5标签引入到PCV2 ORF2末端后，再用携带V5标签的PCV2 ORF2置换PCV1 ORF2，并将其定向克隆至pcDNA3.1真核表达载体，经系列鉴定证明成功构建了pcDNA3.1-PCV1-2m-V5感染性克隆质粒。将该感染性克隆质粒通过肌肉注射接种至昆明小鼠后，分别于第7d、14d、21d、28d、35d、42d断尾采集小鼠血液，并通过PCR对血液样品进行PCV1-2m-V5病原核酸检测，检测结果显示试验小鼠从第7d开始产生PCV1-2m-V5病毒血症，一直持续到第21d，将第14d检测的阳性PCR产物克隆测序，结果显示，该序列与构建的pcDNA3.1-PCV1-2m-V5感染性克隆质粒序列存在5个氨基酸的差异，其余序列一致，表明通过小鼠接种试验，成功拯救获得了PCV1-2m-V5病毒。而后，分别将含有PCV1-2m-V5病毒的阳性血清和PCV2 GZ-RH1病毒接种至PK15细胞，分别以V5标签单克隆抗体和PCV2阳性血清为一抗，对第5代接毒细胞进行IFA检测。以V5标签单克隆抗体为一抗的IFA检测结果显示，在接种PCV1-2m-V5病毒的PK15细胞中检测到了绿色荧光，接种PCV2 GZ-RH1病毒的PK15细胞中无明显荧光；而以PCV2阳性血清为一抗的IFA检测结果显示，接种PCV1-2m-V5和PCV2 GZ-RH1病毒的PK15细胞中均有明显绿色荧光。分别收集接种PCV1-2m-V5和PCV2 GZ-RH1病毒的第5代细胞培养物，以V5标签为一抗进行WesternBlot检测，结果表明接种PCV1-2m-V5病毒的细胞培养物中有特异性目的条带，接种PCV2 GZ-RH1病毒的细胞培养物为阴性，IFA和WesternBlot检测结果表明拯救的PCV1-2m-V5病毒能在感染细胞中产生携带有V5标签的Cap蛋白，利用该特点，可选用血清学方法对拯救病毒与野毒感染进行鉴别。此外，利用携带V5标签的引物分别对接种PCV1-2m-V5和GZ-RH1 PCV2病毒的第5代细胞培养物进行ORF2-V5基因检测，能在接种前者的细胞培养物中检测到特异性条带，而在后者中不能检测到特异性条带，表明可利用该对引物对拯救病毒和野毒进行鉴别。PCV1-2m-V5拯救病毒的电镜形态观察结果显示，在以V5抗体进行的免疫沉淀实验样品中，可见与PCV形态大小一致的病毒粒子，表明第5代细胞培养物中存在携带V5标签的PCV1-2m-V5粒子。
　　本研究成功构建了 pcDNA3.1-PCV1-2m-V5感染性克隆质粒，并获得了PCV1-2m-V5拯救病毒株；初步鉴定表明PCV1-2m-V5可在PK15细胞中增殖，利用实验设计的特异性引物可以对PCV1-2m-V5与其他PCV2毒株进行区别，针对拯救病毒既能对V5抗体产生免疫学反应，也能对Cap蛋白抗体产生免疫学反应，提示应用V5蛋白标记的ELISA可对该拯救病与PCV2野毒抗体进行区别，该研究为PCV2 iDNA标记疫苗的研制奠定了基础。

目录

第一章 文献综述

1病原学

2 PCV分子生物学

3流行病学

4 PCV2疫苗的研究进展

5 展望

6 试验目的及意义

第二章PCV2贵州分离株的基因型及生物信息学分析

1 材料

2 方法

3结果

4讨论

5结论

第三章 携带遗传标记的PCV1-2m-V5嵌合病毒感染性克隆质粒的构建

1 材料

2 方法

3 结果与分析

4.0Wertern Blot试验结果

5讨论

6结论

参考文献

附录一攻读硕士学位期间发表的学术论文

致谢

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