丁酸梭菌早期干预对大肠杆菌攻毒肉鸡肠道免疫功能和盲肠菌群结构的影响

摘要

丁酸梭菌（Clostridium butyricum），是一种专性厌氧的革兰氏阳性芽胞杆菌，也称酪酸菌。丁酸梭菌及其代谢物能促使乳酸菌等多种肠道有益菌的增殖，抑制大肠杆菌等病原菌的增殖，亦可防治肠道内微生态区系的紊乱，同时还能降解多糖类物质。本文研究了丁酸梭菌对大肠杆菌生长的抑制、肠道炎症因子和抗菌肽表达的影响、肠道菌群结构的影响，为改善动物的健康状况提供参考。论文分为三个部分。 试验一：丁酸梭菌的代谢及对大肠杆菌鞭毛基因和毒力基因表达的影响。试验采用丁酸梭菌MIYAIRI II 588分别在有氧和无氧的环境用MRS培养基进行培养，于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h取样测定短链脂肪酸（SCFA）。同时用LB肉汤培养产肠毒素大肠杆菌（ETEC），与不同浓度（106 cfu/mL、107 cfu/mL、108cfu/mL）丁酸梭菌共培养，在1 h、2 h、4 h、6 h、12 h时取样进行实时荧光定量PCR，检测其鞭毛蛋白基因faeG的表达变化，同时检测2h时各组大肠杆菌毒力基因estA、estB的表达变化。结果显示，（1）无氧环境下丁酸梭菌培养液中的乙酸、丙酸、异丁酸、戊酸、异戊酸在不同的时间点中均无显著性差异（P>0.05），丁酸到 8 h 之前为 0.015 mmol/L~0.031 mmol/L ， 12 h 为 0.462mmol/L （ P<0.01 ）。24 h 以后丁酸含量极显著的提高至8.213~9.173mmol/L（P<0.01）。有氧环境下丁酸梭菌培养液中的丁酸在12 h前有增长趋势但并无显著性差异（P>0.05），24 h显著增长到0.109 mmol/L（P<0.01），到36 h极显著增长到6.561 mmol/L（P<0.01）；（2）在对照组中ETEC 的faeG相对表达量在不同时间都在一个较高的水平，加入106 cfu/mL、107 cfu/mL、108 cfu/mL的丁酸梭菌后， faeG表达量都出现了显著的下降的趋势（P<0.05），同时，共同作用2 h后，丁酸梭菌显著的抑制了产毒基因（estA、estB）的表达（P<0.01）。 试验二：丁酸梭菌对ETEC攻毒肉鸡生长性能、肠道炎症反应相关因子和抗菌肽基因表达的影响。试验选用健康的1日龄肉鸡200只，在1~3日龄阶段，分别进行如下处理：（1）随机选择100只，每天灌喂1 mL生理盐水；（2）另外100只灌喂1mL浓度为109 cfu/mL的丁酸梭菌。于7日龄阶段，生理盐水处理肉鸡分成：① 对照组（Control），② 大肠杆菌组（EC）；丁酸梭菌处理肉鸡分成：③丁酸梭菌组（CB），④ 丁酸梭菌+大肠杆菌组（CB+EC），其中EC组和CB+EC均分别灌喂1mL 108cfu/mL ETEC菌液进行攻毒，而Control组和CB则灌喂1mL生理盐水。分别在肉鸡3、5、7、10、14和28日龄称重，并在攻毒后翻肛检查鸡群的下痢情况。并ETEC攻毒后的第3和7 d（即10和14日龄）屠宰取肠道组织。结果显示：（1）在7~10 d时CB组的料重比显著降低（P?0.05）。14日龄时CB组、CB+EC组与对照组相比，体重分别提高了19.78%（P?0.05）、20.63%（P?0.05）。（2）对于回肠组织的炎症反应相关基因表达水平，10日龄时（即攻毒后第3 d）TNFα、IL-1β各组间无显著性差异（P>0.05）。与EC组和EC+CB组比较，CB组IL-8和TLR4基因的表达量显著降低（P?0.05），而IL-10基因的表达量显著升高（P?0.05）。在14日龄时（即攻毒后第7 d），TNFα、IL-1β、IL-8的表达量在各组间无显著性差异（P>0.05）。CB组IL-10的表达量显著高于与EC组（P?0.05），而Control组和CB组TLR4的表达量显著低于EC组与CB+EC（P?0.05）。（3）对于回肠组织抗菌肽基因的表达水平，10日龄时（即攻毒后第3 d）AvBD9和Cath-B1表达量在各组间无显著性差异（P>0.05），AvBD10在CB组中表达量极显著高于其他处理组（P<0.01）。在14日龄时（即攻毒后第7 d），AvBD9的表达量在CB组与EC组中显著增加（P<0.01），Cath B1表达量相对于Control组在其余各组中均显著增加（P<0.01）。（4）在盲肠组织中，在10日龄时AvBD9基因的表达量在各组间无显著性差异（P>0.05）， Cath-B1的基因表达量Control组显著高于CB+EC组，而CB组AvBD10基因表达量显著高于其他实验组（P<0.05）。在14日龄时， CB组与CB+EC组的AvBD10基因表达量均显著高于Control组与EC组（P<0.05），AvBD9与 Cath-B1基因的表达量在各组间无显著性差异（P>0.05）。 试验三：丁酸梭菌对大肠杆菌攻毒肉鸡肠道菌群结构及短链脂肪酸谱的影响。取试验二中所采集的盲肠内容物用于高通量测序分析菌群结构，并将回肠和盲肠内容物用于短链脂肪酸含量测定。结果显示，（1）10 日龄时（即攻毒后第3 d），在门水平上，厚壁菌门（Firmicutes）为各组的优势菌门，相对丰度均在 93%以上。在属水平上，乳 酸杆菌属（Lactobacillus）、毛螺菌属（Lachnospiraceae）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）、丁酸球菌属（Butyricicoccus）魏斯氏菌属（Weissella）、芽孢杆菌属（Bacillus）为优势菌属；乳酸杆菌属相对丰度最高。在14日龄时（即攻毒后第7 d），厚壁菌门同样也是各组的优势菌门，相对丰度均在76%以上。属水平上，乳酸杆菌属(Lactobacillu)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、毛螺菌属(Lachnospira)、柔嫩梭菌属(Faecalibacterium)、链球菌属(Streptococcus)、丁酸球菌属(Butyricicoccus)、Blautia、芽孢杆菌属(Bacillus)为优势菌属。由于优势菌群不同，10 d、14 d的菌群结构有一定差异。（2）回肠中SCFAs含量降低， 10 d 时乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸在各组的含量分别为 0.138~0.175mg/g、0.014~0.017mg/g、0.012~0.016mg/g、0.049~0.074mg/g；14 d时乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸在各组的含量分别为 0.104~0.169mg/g、0.012~0.016mg/g、0.003~0.006mg/g、0.063~0.084mg/g，且各组间差异不显著（P>0.05）。在盲肠中，10 日龄时 CB 组乙酸含量显著高于其他试验组（P<0.01），CB组和CB+EC组丁酸含量显著高于Control组和EC组（P<0.01）；14日龄时，CB组乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸含量均显著高于Control组和EC组（P<0.05）。 综上所述，在体外条件下，丁酸梭菌可抑制大肠杆菌毒力基因和粘附基因的表达。在肉鸡试验中，丁酸梭菌早期干预可以在一定程度上降低大肠杆菌攻毒肉鸡肠道中的炎症反应和提高抗菌肽基因的表达促进肠道菌群的生产短链脂肪酸，从而减少大肠杆菌引起的下痢, 通过基于 OTU 水平的主成分分析发现，丁酸梭菌早期干预可以在一定程度上改变盲肠的菌群结构。

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