DNase抑制肺炎链球菌青霉素耐药基因转移的研究

摘要

当前，细菌耐药已经成为严重的公共卫生危机，严重威胁着人类的身体健康和生命安全，大有逐渐加重之势，是人类面临的亟待破解的难题。破解细菌耐药尽管需要加大研发杀伤耐药菌的新药、合理使用抗菌药物、适度补充益生菌等，但是这些措施似乎仍不能实现破解细菌耐药的难题。导致这一局面的重要原因是这些基本防治对策不能抑制由细菌转化、转导和接合引起的细菌耐药基因的水平传播，以及由此引起的耐药细菌的快速蔓延。基于上述细菌耐药的严重形势以及现有防治对策的分析，本研究试图以肺炎链球菌转化为模型，以肺炎链球菌标准菌株为受体菌，以青霉素耐药肺炎链球菌为供体菌，探究DNase干预肺炎链球菌青霉素耐药基因转移的作用，以便为深入研究切断细菌耐药基因水平传播提供新的思路和方法。 本研究方法分为四个基本阶段。在第一实验阶段，主要对后续转化和抑制转化实验中的受体菌及供体菌进行基本生物学性状检测，以便为后续实验提供可靠的基本要素和有关数据。这些基本生物学性状检测主要包括受体菌及供体菌的optochin试验、青霉素结合蛋白基因鉴定以及生长曲线测定；在第二实验阶段，为了给后续转化和抑制转化实验提供含青霉素耐药基因的外源性DNA和有关数据，主要提取受体菌和供体菌的DNA，然后分别获取这两菌株pbp2x,pbp2b和pbp1a目的基因，再对这些目的基因进行测序，最后将这些测序结果与肺炎链球菌R6株相应基因序列进行同源性比对。将用于后续实验的供体菌DNA提取液进行体积、浓度和纯度的测定以及进行供体菌的苯唑西林药敏试验；在转化实验的第三阶段，首先进行受体菌的苯唑西林药敏试验并将生物学性状符合受体菌要求的肺炎链球菌标准菌株进行转化培养。在持续培养6h受体菌开始进入感受态即对数生长期后期时，将含青霉素耐药基因的外源性DNA和生理盐水分别加入实验组和对照组中。待持续培养9h后停止培养并将转化后的细菌悬液涂板以进行optochin和苯唑西林药敏试验鉴定。待试验鉴定后，将实验组和对照组苯唑西林药敏抑菌环边缘的肺炎链球菌pbp2x,pbp2b和pbp1a基因分别进行测序和BLAST比对；在抑制转化实验的第四阶段，将受体菌肺炎链球菌标准菌株进行抑制转化培养。在持续培养6h受体菌开始进入感受态时，将含青霉素耐药基因的外源性DNA和DNase 加入实验组中，将含青霉素耐药基因的外源性DNA加入对照组中。待持续培养9h后停止培养并将抑制转化后的细菌悬液涂板以进行optochin和苯唑西林药敏试验鉴定。待试验鉴定后，将实验组和对照组苯唑西林药敏抑菌环边缘的肺炎链球菌pbp2x,pbp2b和pbp1a基因分别进行测序和BLAST比对。 本研究的结果及分析可分为四个部分。①第一实验阶段的结果及分析：受体菌和供体菌的optochin试验和青霉素结合蛋白基因鉴定均为阳性，这两株细菌生长曲线为转化和抑制转化实验提供了加入外源性DNA的时间窗和停止培养的时间点；②第二实验阶段的结果及分析：受体菌的pbp2x,pbp2b和pbp1a基因序列片段与肺炎链球菌R6株相应基因序列的同源性百分比分别为99.2%，99.4%和99.8%（序列改变均＜1%），而供体菌与肺炎链球菌R6株相应基因序列的同源性百分比分别为94.7%,82.6%和82.1%（序列改变均＞1%）。而供体菌苯唑西林药敏试验的抑菌环直径均＜19mm，表明供体菌为青霉素耐药肺炎链球菌。这些结果还表明受体菌内的青霉素结合蛋白基因为青霉素敏感基因，而供体菌内的青霉素结合蛋白基因为青霉素耐药基因，这进而说明由供体菌提取的外源性DNA含有肺炎链球菌青霉素耐药基因。供体菌满足转化和抑制转化的要求。③第三实验阶段的结果及分析：受体菌苯唑西林药敏试验的抑菌环直径均＞20mm，表明受体菌为青霉素敏感肺炎链球菌，受体菌满足转化和抑制转化的要求。optochin＞15mm,此结果表明转化过程中未受到杂菌污染，转化后的细菌为肺炎链球菌；实验组和对照组苯唑西林药敏试验抑菌环直径分别为（23.7±2.1）mm和（33.9±3.0） mm，两组数据P＜0.01，并且实验组苯唑西林药敏试验出现了特征性抑菌环带而对照组未出现这一特征。这些结果则表明实验组肺炎链球菌获得了新的青霉素低敏感性状；实验组肺炎链球菌的pbp2x,pbp2b和pbp1a基因序列片段与肺炎链球菌R6株相应基因序列的同源性百分比分别为97.3%、89.5%和98.9%（序列改变均＞1%），而对照组肺炎链球菌与肺炎链球菌R6株相应基因序列的同源性百分比分别为99.2%,99.3%和99.1%（序列改变均＜1%）。这些结果则暗示受体菌在转化过程中成功地摄入和重组了肺炎链球菌青霉素耐药基因。④第四实验阶段的结果及分析：optochin＞15mm,此结果表明抑制转化过程中未受到杂菌污染，抑制转化后的细菌为肺炎链球菌；实验组和对照组苯唑西林药敏试验抑菌环直径分别为（30.6±4.1）mm和（18.7±7.8）mm，两组数据P＜0.01，并且实验组与对照组比较苯唑西林药敏试验的特征性抑菌环带明显减弱。这些结果则表明DNase抑制了实验组的肺炎链球菌标准菌株转化为青霉素低敏感肺炎链球菌；实验组肺炎链球菌的pbp2x,pbp2b和pbp1a基因序列片段与肺炎链球菌R6株相应基因序列的同源性百分比分别为98.6%、99.0%和98.9%，而对照组肺炎链球菌与肺炎链球菌R6株相应基因序列的同源性百分比分别为95.4%,90.5%和98.9%。这些结果则暗示实验组的肺炎链球菌标准菌株在转化为青霉素低敏感肺炎链球菌过程中受到了DNase不同程度的抑制。这种抑制的分子机制就是DNase通过降解细菌外环境中的DNA使携带耐药基因的DNA被水解成平均为4个核苷酸的片段从而失去基因活性。因此DNase抑制肺炎链球菌标准菌株转化为青霉素低敏感肺炎链球菌的基本原理是DNase干预了肺炎链球菌青霉素耐药基因的转移。 DNase抑制肺炎链球菌青霉素耐药基因转移的结论将为更加深入地研究阻抑耐药基因水平传播和遏制耐药细菌的形成提供新方法，也为研发相关新药提供新思路。

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