含1,3,4-噁二唑的砜类系列化合物对茶树叶斑病病原菌可可毛色二孢的抑菌机理初步研究

摘要

可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae）导致的茶树叶斑病是在贵州茶区发现的一种新型茶叶病害，其在贵州惠水县茶区田间发生率达到30至45%。含1,3,4-噁二唑的砜类化合物具有高效、低毒及广谱的生物活性而被广泛应用在新型绿色农药的设计研究中。 本论文在明确可可毛色二孢生物学特性的基础上，测试了5个含1,3,4-噁二唑的砜类化合物对可可毛色二孢的抑菌活性。结果显示，甲磺酰菌唑对可可毛色二孢的离体抑菌活性最好（EC50为3.54μg/mL），甲磺酰菌唑在50和100μg/mL对可可毛色二孢导致的叶斑病的治疗活性分别为14.55%和41.78%，与相同浓度戊唑醇的治疗活性相当（分别为14.08%和38.50%）。 本论文研究的重点是甲磺酰菌唑对可可毛色二孢的抑菌作用机理。甲磺酰菌唑处理可可毛色二孢菌丝后，光学显微镜结果显示菌丝分支减少、变短、扭曲、畸形和深色物质在菌丝内积累，扫描电镜结果显示菌丝塌陷和皱缩，透射电镜结果显示细胞膜、细胞壁和细胞器模糊以及细胞内空腔化，4',6-diamidino-2-phenylindole染色实验显示细胞核减少和模糊不清，Calcofluor white染色实验显示隔膜距离变短和菌丝内几丁质积累，电导率实验结果显示菌丝细胞膜通透性增加，高效液相色谱仪分析显示菌丝麦角甾醇含量下降。 转录组测序后，以筛选阈值为padj<0.05且|log2FoldChange|>1筛选到2084个差异基因，包括899个上调基因和1185个下调基因。GO富集分析显示，甲磺酰菌唑处理组与对照组之间的差异基因主要富集在生物学过程中的碳水化合物代谢过程、单组织碳水化合物代谢过程和细胞碳水化合物代谢过程，细胞成分中的膜区、次级内体和次级内体膜，分子功能中的催化活性、辅因子结合、水解酶活性和糖基键功能等。同时采用荧光定量PCR（RT-qPCR）验证了16个差异基因的表达趋势。 同时，本论文也将转录组中的差异基因富集到KEGG通路中。我们尤其关注的是可可毛色二孢甾醇合成通路中的差异基因，因为甾醇合成通路中的基因与细胞膜成分和甾醇生物合成密切相关。结果显示，可可毛色二孢甾醇合成通路中有6个基因上调及2个基因下调。以RT-qPCR研究了甲磺酰菌唑处理后可可毛色二孢菌丝麦角甾醇合成通路中的差异基因表达趋势。整体而言，法尼基二磷酸法尼基转移酶（farnesyl-diphosphate farnesyltransferase，FDFT1）、角鲨烯单加氧酶（squalene monooxygenase，ERG1）、甾醇14α-去甲基化酶（sterol14alpha-demethylase，CYP51）、Delta-14-甾醇还原酶（Delta-14-sterol reductase，ERG24）、3-酮类固醇还原酶（3-keto steroid reductase，ERG27）和甾醇22-去饱和酶（sterol22-desaturase，ERG5）基因表达上调，溶酶体酸性脂肪酶/胆固醇酯水解酶（lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase，TGL4）基因表达下调。 本论文能为含1,3,4-噁二唑砜类化合物的进一步开发提供依据，并有助于由可可毛色二孢导致的茶树叶斑病的田间防控。

目录

缩略词列表

第一章 文献综述

1.1茶树、茶树叶斑病及可可毛色二孢研究进展

1.2防治茶树叶斑病的化学农药研究进展

1.3含1,3,4-噁二唑的砜类化合物研究进展

1.4抑菌机理方法研究进展

1.4.1形态学方法研究进展

1.4.2生理生化方法研究进展

1.4.3转录组分析研究进展

1.4.4荧光定量PCR研究进展

1.5结语

第二章 论文设计思想和目的

2.1研究目的和意义

2.2拟解决的主要问题

2.3研究内容

2.4研究思路

第三章 实验部分

3.1实验材料

3.1.1实验仪器（器材）

3.1.2实验试剂

3.1.3供试化合物

3.1.4供试菌株

3.1.5供试植物

3.2可可毛色二孢生物学特性的研究

3.2.1病原菌的致病性测试

3.2.2温度对可可毛色二孢菌丝生长的影响

3.2.3 pH对可可毛色二孢菌丝生长的影响

3.2.4不同碳源对可可毛色二孢菌丝生长的影响

3.2.5不同氮源对可可毛色二孢菌丝生长的影响

3.2.6可可毛色二孢生长曲线

3.2.7数据处理

3.3含1,3,4-噁二唑的砜类化合物抑菌活性测试

3.3.1离体抑菌活性测试

3.3.2活体抑菌活性测试

3.4形态学研究

3.4.1光学显微镜观察

3.4.2扫描电镜和透射电镜观察

3.4.3甲磺酰菌唑对细胞核的影响

3.4.4甲磺酰菌唑对细胞壁及隔膜的影响

3.5生理生化指标测定

3.5.1细胞膜通透性测定

3.5.2麦角甾醇含量测定

3.6转录组分析

3.6.1实验设计

3.6.2样品制备

3.6.3总RNA提取及检测

3.6.4 cDNA文库构建

3.6.5上机测序

3.6.6转录本拼接

3.6.7基因功能注释

3.6.8基因表达水平分析

3.6.9 RNA-seq整体质量评估

3.6.10 基因差异表达分析

3.6.11 差异基因GO富集分析

3. 6.12 差异基因KEGG富集分析

3.7.1实验设计

3.7.2引物

3.7.3样品制备

3.7.4总RNA提取

3.7.5第一链反转录

3.7.6实时荧光定量PCR

3.7.7数据处理

3.8.1实验方法

3.8.2引物

3.8.3样品制备

3.8.4 RNA提取

3.8.5第一链反转录

3.8.6荧光定量 PCR

3.8.7数据处理

第四章 实验结果

4.1可可毛色二孢生物学特性的研究

4.1.1可可毛色二孢的致病性测试

4.1.2温度对可可毛色二孢菌丝生长的影响

4.1.3 pH对可可毛色二孢菌丝生长的影响

4.1.4 不同碳源培养基对可可毛色二孢菌丝生长的影响

4.1.5 不同氮源培养基对可可毛色二孢菌丝生长的影响

4.1.6可可毛色二孢的生长曲线

4.2含1,3,4-噁二唑的砜类化合物的抑菌活性测试

4.2.1离体抑菌活性测试

4.2.2活体抑菌活性测试

4.3形态学研究

4.3.1光学显微镜观察

4.3.2扫描电镜和透射电镜观察

4.3.3甲磺酰菌唑对细胞核的影响

4.3.4甲磺酰菌唑对细胞壁及隔膜的影响

4.4甲磺酰菌唑对可可毛色二孢生理生化性质的影响

4.4.1甲磺酰菌唑对可可毛色二孢细胞膜通透性的影响

4.4.2甲磺酰菌唑对可可毛色二孢菌丝麦角甾醇含量的影响

4.5转录组学分析

4.5.1 RNA质量检测

4.5.2测序数据质量汇总

4.5.3基因功能注释

4.5.4基因表达水平分析

4.5.5样品间相关性检查

4.5.6差异表达分析

4.5.7差异基因GO富集分析

4.5.8差异基因KEGG富集分析

4.6荧光定量PCR验证转录组差异基因

4.7甲磺酰菌唑对麦角甾醇合成通路基因表达的影响

第五章 讨论

第六章 结论

6.1 主要研究结论

6.2创新点

6.3不足及展望

致谢

参考文献

附录

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