茶氨酸的异源合成和活性分析

摘要

茶氨酸（Theanine）是一种不参与蛋白组成的游离氨基酸，具有降血压、提高免疫力、抑制兴奋、减轻体重、缓解精神压力、提高学习能力和记忆力等广泛的药用和保健价值。微生物异源表达合成目标产品具有周期短、规模化、成本低、产品天然等优势，是对直接分离提取和化工合成等传统生产途径的重要补充。本研究探究了利用工业模式微生物大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）和益生菌乳酸菌（lactic acid bacteria,L.lactis）表达γ-谷氨酰胺转肽酶（GGT）异源合成茶氨酸的可行性，以为茶氨酸的高效、规模和安全生产提供依据。主要研究内容和结果如下： 1.E.coliγ-GGT基因的筛选和功能预测。从NCBI公共数据库中根据同源性筛选到1条γ-GGT基因（NCBI no.EG10374;E.coli K-12），生物信息学分析表明其编码580个氨基酸，酶蛋白为酸性不稳定亲水性蛋白，分子量为61.7kDa，具有信号肽序列和保守的功能结构域，在细胞周质中发挥作用，在进化上较为保守。 2.γ-GGT基因的E.coli工程菌构建。对E.coliγ-GGT基因进行乳酸菌偏嗜性改造后人工合成序列，与pET28a质粒连接后构建E.coli pET28a-GGT表达载体，经CaCl2法转化E.coli BL21菌株。菌落PCR和双酶切检测表明成功构建γ-GGT E.coli表达载体和重组工程菌。 3.E.coli工程菌异源合成茶氨酸体系的建立。通过单因素实验和三因素三水平正交实验，对诱导温度、诱导剂浓度、诱导时间和不同底物浓度进行优化，建立E.coli工程菌异源合成茶氨酸体系：（1）重组蛋白的诱导。温度为30℃，IPTG浓度为0.2mmol/L时诱导4h；（2）GGT酶的催化反应体系。160rmp，30℃，1ml反应体系中（菌量70mg/ml，pH9.5），谷氨酰胺（L-Gln）浓度为0.25M、盐酸乙胺浓度为2.0M，反应8h。该体系获得的茶氨酸含量为2932.02nmol/mL菌液。 4.E.coli工程菌异源合成的茶氨酸活性分析。以茶氨酸标品和0.2%DMSO为对照，发现E.coli工程菌催化合成的茶氨酸（粗提液）对人体前列腺PC3癌细胞的增殖具有明显抑制作用，以粗提液50倍稀释时最为显著；茶氨酸粗提液对LTT T淋巴细胞具有保护作用，低稀释倍数时这种保护作用最为明显。 5.γ-GGT基因的L.lactis工程菌构建。将经乳酸菌偏嗜性改造后的E.coliγ-GGT基因与pNZ804质粒连接构建表达载体pNZ8048-GGT，通过电击法转化乳酸菌。菌落PCR和双酶切检测表明，成功构建γ-GGT乳酸菌表达载体和获得L.lactis NZ3900/pNZ8048-GGT工程菌菌株。Real-time PCR分析发现，9株重组菌株中目的基因拷贝数分别为25、13、7、1207、204、443、1、18、6234、5943。 6.L.lactis工程菌异源合成茶氨酸体系的建立。通过单因素和酶联免疫吸附试验（ELISA）对诱导剂Nisin的浓度和诱导时间进行优化。结果表明，采用3ng/ml的Nisin诱导表达4h时，由γ-GGT基因编码的γ-谷氨酰胺转肽酶酶活性最高。

目录

第一章 文献综述

1 茶氨酸及其生物学作用

1.1 茶氨酸概述

1.2 茶氨酸的生物学作用

2 茶氨酸代谢的酶学研究

3 茶氨酸的制备与生产

3.1 化学合成和工业生产

3.2 天然物中直接分离提取

3.3 生物合成与基因工程生产

4 大肠杆菌在工业化生产中的应用现状

5 乳酸菌在工业化生产中的应用现状

6 研究意义和目的

第二章 大肠杆菌工程菌异源合成茶氨酸

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 结果与分析

2.1 GGT蛋白的理化性质和亚细胞定位的预测

2.2 GGT蛋白的信号肽和疏/亲水性特性

2.3 GGT蛋白的二级结构组成与分布

2.4 GGT蛋白的三级结构主要元件

2.5 GGT蛋白的功能结构域

2.6 GGT蛋白的进化特点

2.7 菌落PCR检测结果

2.8 重组质粒双酶切结果

2.9 大肠杆菌工程菌重组蛋白的诱导优化体系

2.10 GGT酶含量

2.11 工程菌合成茶氨酸的检测结果

2.12 茶氨酸的生物学活性

3 讨论

第三章 乳酸菌工程菌异源合成茶氨酸

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 结果与分析

2.1 菌落PCR检测结果

2.2 重组质粒双酶切结果

2.3 乳酸菌工程菌重组蛋白的诱导优化体系

2.4 乳酸菌工程菌拷贝数

3 讨论

第四章 结论与展望

1 主要结论

2展望

参考文献

致谢

附录

声明