HPV11型L2E7融合蛋白的原核表达及其免疫效果观察

摘要

本文根据各种流行病学资料，肛门生殖器疣(GW)是世界上一个不容忽视的公众健康问题，每年用于GW的诊断治疗费用给人们带来了不小的经济负担。传统的治疗方法存在一定的缺陷，而且复发率高，于是人们在寻找更有效的治疗或辅助治疗方法。 GW与人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)6型和11型的密切关系10年前就已经明确。GW病灶会由一个逐渐扩增成多个，常常是旧的和新的疣体并存。可以解释为当上皮细胞局部受损伤的时候，上皮细胞的完整性遭到破坏，旧病灶脱落释放的HPV通过表皮的微小创伤进入组织，感染新的上皮基底层细胞。所以被HPV感染的细胞受感染的程度不一：处于非整合状态的部位，HPV的早晚期基因E6、E7、L1、L2都有表达；与宿主细胞DNA整合的仅能检测到E6、E7的表达；对于这种纷乱混杂的感染状态，就应该既要预防HPV的扩散感染，又要清除已被感染的细胞和相关病灶。 鉴于上述原因，人们一直在研制HPV疫苗，通过预防和治疗HPV感染的策略，达到预防和治疗GW的目的。预防性疫苗免疫策略主要集中在如何诱发出针对HPV相关表位的高滴度中和抗体来预防感染。以HPV衣壳蛋白L1，L2为靶抗原制备的病毒样颗粒(VLP)是预防性疫苗的主流，目前Merk公司的16、18、6、11型四价VLP疫苗已经上市。治疗性疫苗的关键是诱发针对病毒蛋白的细胞免疫，清除病灶和感染细胞，由于HPV-6,11型的两个早期蛋白E6，E7在疣体中持续表达，并且与疣复发密切相关，它们是治疗性疫苗理想的靶抗原。由英国和比利时分别研制的HPV6b L2E7融合蛋白疫苗都已经进行了Ⅱ期临床实验。 本研究在实验室已构建的HPV6bL2E7、HPVl6L2E7治疗性疫苗基础上，构建HPV11L2E7融合蛋白原核表达系统，得到纯化的L2E7蛋白，并在小鼠HPVll型L2E7融合蛋白的原核表达及其免疫效果观察体内评价其免疫原性。首先我们从尖锐湿疣组织经PCR扩增获得人乳头瘤病毒11型L2、E7编码区基因，其序列与发表的序列比对(序列号M14119)，L2有两处突变，因未引起氨基酸的改变，为同义突变；E7有一处碱基由“G”变为“T”，相应位置的氨基酸由“A”变为“S”。构建pMDl8T HPVllL2E7质粒，测序证实获得了L2E7融合基因。将融合的L2E7基因连接至缺失His的原核表达载体pET9a，构建pET9a HPVllL2E7原核表达重组质粒。在大肠杆菌宿主菌BL21(DE3+)中经IPTG诱导高效表达了L2E7融合蛋白(553个氨基酸)，经SDS-PAGE电泳和Western Blotting鉴定，表明成功表达了L2E7蛋白。诱导表达L2E7蛋白，收获、洗涤包涵体溶解于8M尿素(PH 8.3)进行CM离子交换介质纯化，纯化的蛋白通过Gel-Pro 3.1软件分析其纯度为83.8％。纯化的L2E7蛋白与佐剂CpG-ODN和氢氧化铝免疫6～8周龄的BALB/c小鼠，进行细胞、体液免疫指标的检测。酶联免疫斑点实验(Enzyme linkedimmunospot，ELISPOT)显示，经该蛋白两次免疫后，小鼠脾单个核细胞(SMNC)体外HPVllE7肽库特异性IFN-γ分泌的斑点数为42.5±6.473/8 x10<'5>脾细胞，与对照组(1.8±0.7528/8 × 10<'5>脾细胞)相比较，差别具有统计学意义(Q=16.3600，P<0.01)。细胞因子染色表明，实验组CD4/IFN-γ双阳性的细胞比例为1.8±0.1％，CD8/IFN-γ双阳性的细胞比例为0.3±0.1％，都高于对照组。酶联免疫吸附实验(ELISA)检测小鼠血清中L2和E7的特异性抗体，L2<,100-120>和E7的IgG都达到了1：8000。 综上所述，原核表达纯化的HPVllL2E7融合蛋白不仅可以在小鼠体内引起HPVllE7特异性的细胞免疫反应，并且也能诱发针对HPVllL2和E7的特异性体液免疫反应，能作为尖锐湿疣免疫治疗候选疫苗。

目录

论文说明：英文缩写

声明

前言

第一部分HPV11L2E7融合蛋白的表达纯化及鉴定

材料和方法

结果

1.HPV11型阳性尖锐湿疣标本的筛选

2.HPV11L2 和 E7 DNA片断的PCR扩增

3.HPV11L2 和 E7 DNA片断克隆质粒的构建

4.HPV11L2E7融合基因的克隆构建

5.HPV11L2E7融合蛋白原核表达重组质粒的构建

6.HPV11L2E7融合蛋白的表达

7.Western Blotting检测大肠杆菌中目的蛋白的表达

8.HPV11 L2E7融合蛋白表达条件的优化

9.HPV11 L2E7融合蛋白的纯化

第二部分HPV11L2E7融合蛋白免疫效果观察

材料和方法

结果

1.用于 HPV11 L2E7疫苗E7抗体检测的GSTE7'蛋白的表达和纯化

2.CpG序列的测活

3.细胞免疫

4.体液免疫

讨论

论文参考文献

小结

【综述 】HPV疫苗的研究进展

附录

致谢