广西眼镜蛇毒L-氨基酸氧化酶体外抗肿瘤作用的实验研究

摘要

目的：研究从广西眼镜蛇毒中分离纯化的L-氨基酸氧化酶(LAAO)的体外抗肿瘤作用，并从LAAO与H<,2>O<,2>的联系、细胞凋亡的角度及LAAO对肿瘤细胞周期分布的影响等探讨LAAO体外抗肿瘤作用的作用机制。 方法： 1．用DEAE-Sepharose CL-6B离子交换及CM-Sepharose CL-6B离子交换层析法分离纯化广西眼镜蛇毒中的L-氨基酸氧化酶(LAAO)，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳在还原和非还原条件下测定其蛋白纯度和分子量。 2．采用MTT法及台盼蓝拒染法，以生理盐水(N.S.)为阴性对照，5-Fu为阳性对照药，人肝细胞株LO2作为正常细胞对照，观察LAAO不同浓度、不同作用时间对人慢性髓性白血病细胞系K562、人肝癌细胞系Bel-7404及人胃癌细胞系SGC7901三种人肿瘤细胞体外增殖的抑制作用。 3．用MTT法检测过氧化氢酶对LAAO及H<,2>O<,2>对K562细胞系细胞毒性作用的影响。 4．用倒置相差显微镜、H.E.染色、透射电镜、TUNEL方法观察不同浓度LAAO对K562、Bel-7404及SGC7901三种肿瘤细胞凋亡的影响。 5．利用流式细胞术检测LAAO对K562、Bel-7404、SGC7901三种人肿瘤细胞周期分布的影响。 结果： 1．从广西眼镜蛇毒中分离出达到电泳纯的L-氨基酸氧酶，其分子量为55.2KD。 2．LAAO对K562、Bel-7404、SGC7901三种人肿瘤细胞及人正常肝细胞LO2均有细胞毒性作用，均显示出良好的量效关系，相关系数r值均大于0.95(p<0.05)。MTT法检测LAAO处理以上三种肿瘤细胞及正常肝细胞24h，LAAO的IC50分别为0.6U/ml、3.37U/ml、4.74U/ml和5.85U/ml，LAAO对正常肝细胞株LO2毒性与对肿瘤细胞毒性比较，其IC<,50>分别为K562、Bel-7404、SGC7901三种肿瘤细胞的9.75、1.74、1.23倍。而5-Fu作用于以上三种肿瘤细胞及正常肝细胞24h后，其抑制率分别为46.22％、42.99％、41.75％及46.45％。台盼蓝拒染法检测到K562、Bel-7404、SGC7901三种人肿瘤细胞经LAAO处理24、48、72h后，生长明显受抑制，细胞生长抑制效应均随LAAO作用时间的延长而增强，浓度效应关系及时间效应关系显著，相关系数r均大于0.95(p<0.05)。 3．LAAO(1.36U/ml)及H<,2>O<,2>(0.03mM)处理K562细胞后，细胞毒性作用明显(p<0.01)，且两者的毒性作用相当(组间比较p>0.05)，细胞活率均为6.4％。当加入同等剂量的过氧化氢酶(Catalase)分别与上述剂量的H<,2>O<,2>及LAAO共同处理细胞24h，H<,2>O<,2>+Catalase组细胞活力完全恢复；而LAAO+Catalase组细胞活力并未完全恢复，而只达到了78.49％。 4．形态学观察LAAO处理K562、Bel-7404、SGC7901三种人肿瘤细胞24h后均可见到较多典型的细胞凋亡表现，随LAAO浓度的增高各肿瘤细胞株中凋亡细胞的数目增多，TUNEL法半定量检测出各细胞株中低高浓度药物处理细胞24h的凋亡指数(AI)分别为：K562细胞，15.1％及29.53％；Bel-7404细胞，29.34％及54.66％；SGC7901细胞，17.07％及30.57％。 5．LAAO可以使K562细胞周期阻滞于G<,0>/G<,1>期，并随药物浓度的增高阻滞于该期的细胞比例增多；而对Bel-7404细胞，低浓度的LAAO使细胞周期阻滞于G0/G1期与S期两个时期，高浓度LAAO则使该细胞周期阻滞于S期；在SGC7901细胞，LAAO将其细胞周期阻滞于S期，并随药物浓度的增高阻滞于该期的细胞比例增多。 结论：从广西镜蛇毒中分离纯化的L-氨基酸氧化酶(LAAO)，在体外，对所选用的肿瘤细胞K562、Bel-7404、SGC7901有明显的细胞毒性作用，对正常细胞LO2亦有毒性作用，与以上肿瘤细胞比较，LAAO对K562细胞有较高的选择性，而阳性对照药5-Fu则对肿瘤细胞的选择性较差。LAAO所催化产生的H2O2在其抗肿瘤中起到主要作用，LAAO的抗肿瘤机制可能与其诱导细胞凋亡及将细胞周期阻滞于G<,0>/G<,1>期或S期有关。

目录

论文说明：主要缩略语

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材料和仪器

实验步骤和方法

结果

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结论

创新点

参考文献

蛇毒L-氨基酸氧化酶抗肿瘤作用研究进展（综述）

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