DNA甲基化检测方法的建立和广西巴马县人群白细胞DNA总体甲基化水平研究

摘要

本文主要从以下几部分展开： 第一部分： 目的：分别建立检测全基因组DNA总体甲基化水平、以及能对CD11a基因启动子区域甲基化状况进行定量、定位的方法。 方法：HPLC方法1.从流动相、检测波长等方面优化高效液相色谱法检测甲基化水平的实验条件；2.检测dC和5-dmC的混合标准品，分别建立两组分的标准方程；3.分别计算日内精密度、日间精密度和回收率，以评价高效液相色谱法的稳定性和重现性；4.水解DNA，使之成为dC、5-dmC等脱氧核苷；检测DNA水解产物，把峰面积代入标准方程，分别计算两组分的浓度，以5-dmC/(dC+5-dmC)比值代表总体甲基化水平；亚硫酸氢钠-PCR-测序法1.确定亚硫酸氢钠转换模板的浓度和作用时间，并对模板进行转换；2.保留CD11a基因启动子序列中CG不变，用T替代其他所有的C，以转换后的序列设计4对引物并分段扩增之；3.设计相应的4对测序引物以测序PCR产物，将测序所获序列与原序列比对，确定发生甲基化的位点，并定量发生甲基化的频率。 结论：本文所建立的高效液相色谱法能够准确灵敏地检测全基因组总体甲基化水平，检测结果稳定，方法重现性好；亚硫酸氢钠-PCR-测序法能够定量、定位CD11a基因启动子区域甲基化状况，相对于其他方法，省时、省标本。 第二部分： 目的：探索巴马县人群的长寿现象是否与DNA甲基化有关，比较该县人群的总体甲基化水平是否与普通健康人群的一致，分析长寿地区人群基因组DNA甲基化水平随年龄增加而下降的速度是否比一般人群缓慢，以研究长寿与DNA甲基化之间可能存在的相关关系。 方法：1.用非随机抽样法在巴马的长寿村落抽取18-103岁的健康个体为实验组，共84人；在我校一附院接受例行体检的健康人群中抽取77人为对照组，年龄、性别分布与实验组同；2.抽取研究对象外周静脉血2m1，分离白细胞并提取DNA；3.水解DNA成为脱氧核苷后，使用前文建立的高效液相色谱法检测水解产物中的dC和5-dmC浓度，并计算5-dmC/(dC+5-dmC)比值，以比值代表研究对象总体甲基化水平；4.使用统计软件SPSS13.0分析两组人群甲基化比值的差异来反映两组人群总体甲基化水平的差异。 结论：1.对照组和实验组研究对象的基因组DNA总体甲基化水平随着年龄的增长而下降；2.总体而言，来自长寿地区的实验组人群的DNA甲基化总体水平比对照组的高；3.实验组和对照组人群总体甲基化水平发生增龄性降低的速度相同。

目录

论文说明：主要缩略语

声明

第一部分DNA甲基化检测方法的建立

摘要

前言

一、高效液相色谱检测全基因组DNA总体甲基化水平方法的建立

材料和方法

结果

讨论

结论

二、亚硫酸氢钠-PCR-测序法检测CD11a基因启动子甲基化方法的建立

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分广西巴马县人群白细胞DNA总体甲基化水平研究

摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述：DNA甲基化与哀老研究进展

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