冠心Ⅱ号联合骨髓间充质干细胞移植对大鼠急性心肌梗死的影响

摘要

背景：急性心肌梗死(AMI)后最主要的病理生理机制是心肌细胞缺血损伤、坏死，坏死的心肌细胞被纤维细胞所替代，丧失了收缩功能，最后导致不可逆的心室重塑。骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植治疗心肌梗死在动物实验和I期临床研究中已得到肯定的疗效。但心肌梗死后缺血缺氧的环境及早期炎症反应均不利于移植细胞的存活，致使其治疗效果受到限制。冠心II号是一传统的以活血化瘀为治则的方剂，经动物和临床实践证实对冠心病有一定的治疗效果。我们拟将冠心II号联合BMSCs移植作用于心肌梗死动物模型，探讨二者是否具有协同治疗作用。 目的：本实验通过观察冠心II号联合BMSCs移植对大鼠急性心肌梗死模型心功能和心肌纤维化心室重塑的影响，探讨冠心II号和BMSCs移植对急性心肌梗死是否具有协同治疗作用，为临床应用提供依据。 方法：采用差异贴壁培养法培养大鼠BMSCs，采用CM-DiI细胞培养液标记P3代大鼠BMSCs。将74只SD雄性大鼠随机分为正常对照组(n=10)、模型组(n=16)、冠心II号组(n=16)、BMSCs组(n=16)、冠心II号+BMSCs组(n=16)。后4组采用开胸结扎左冠状动脉左前降支(LDA)的方法建立心肌梗死模型，模型建立成功后，模型组和冠心II号组在心肌梗死区及边缘区分5点注射L-DMEM培养液；BMSCs组和冠心II号+BMSCs组在左室心肌梗死区及边缘区分5点注射2×106个CM-DiI标记的P3代BMSCs。心肌梗死造模后第二天开始，冠心II号组和冠心II号+BMSCs组大鼠以剂量为10g/kg，容量为1ml/100g的冠心II号标准汤剂灌胃，1次/d，连续7d;模型组及BMSCs组以1ml/100g的生理盐水灌胃，1次/d，连续7d;正常对照组不建立心肌梗死模型，灌胃同模型组及BMSCs组。细胞移植4W后，应用心脏多普勒超声诊断仪检测以下心功能参数：左室舒张末径(LVIDd，cm)、左室收缩末径(LVIDs，cm)、左室短轴缩短率(FS，％)、射血分数(EF，％)；取出梗死区心肌组织，冰冻切片观察移植细胞；心肌切片Masson染色观察心肌纤维化程度；荧光定量RT-PCR检测TGF-β1基因的表达；抽取心脏血液ELISA法检测血清PI CP、PIIINP的水平。 结果：(1)体外BMSCs原代贴壁生长，为形态均一的长梭形，排列密集。传代至5-6代时细胞基本维持原有形态生长，未出现分化。(2)各组死亡例数：模型组4例，冠心II号组3例，MSCs组4例，冠心II号+MSCs组3例。4组比较无显著差异(P>0.05)。(3)超声心动图检测心功能结果：与正常对照组比较，4个心肌梗死造模组的LVIDd和LVIDs均显著增加(P<0.01)，FS、EF均显著减少(P<0.01)。与模型组相比，冠心II号组、BMSCs组和冠心II号+BMSCs组LVIDd及LVIDs均显著减少(P<0.05或P<0.01)，FS、EF均显著升高(P<0.01)，其中冠心II号+BMSCs组变化幅度优于冠心II号组、BMSCs组(P<0.05或P<0.01)。(4)荧光显微镜下BMSCs组和冠心II号+BMSCs组左室心肌组织冰冻切片可见发出红色荧光的CM-DiI标记移植细胞，其余各组未见阳性细胞。(5) Masson染色切片检测示：正常对照组未见梗死灶和纤维形成，模型组梗死灶贯穿全层心肌，而且面积较大，被纤维疤痕代替，室壁极薄；冠心II号组也有透壁性梗死灶，但面积较小；BMSCs组可见残存的心肌呈岛状分布，瘢痕区域内有心肌细胞和微血管；冠心II号+BMSCs组梗死位于心肌中层，外层仅有少量纤维组织，并可见心肌组织和血管增生，侧枝循环丰富。(6)荧光定量PCR检测结果：各个心肌梗死造模组心肌梗死边缘区TGF-β1mRNA表达水平均显著高于正常对照组(P<0.01)；与模型组比较，冠心II号组、BMSCs组和冠心II号+BMSCs组的心肌梗死边缘区TGF-β1m RNA表达水平显著降低(P<0.01)；其中冠心II号+BMSCs组变化幅度优于冠心II号组和BMSCs组(P<0.05)。(7)ELISA检测结果：心肌梗死造模后，血清PICP、PIIINP水平均显著升高(P<0.01)，显示体内的I型和III型胶原合成增加。与模型组比较，冠心II号组、BMSCs组和冠心II号+BMSCs组血清PI CP、PIIINP水平均显著降低(P<0.01)；其中冠心II号+BMSCs组变化幅度优于冠心II号组和BMSCs组(P<0.01)。 结论：(1)单纯冠心II号汤剂治疗或BMSCs移植以及两者联合均可改善心肌梗死大鼠心功能，减少心室扩张程度，但两者联合情况下效果最佳，对心肌梗死具有协同治疗作用(2)单纯冠心II号汤剂治疗或BMSCs移植以及两者联合均可减少心肌梗死大鼠胶原形成，减轻心肌纤维化程度，但两者联合情况下效果最佳，可能与下调TGF-β1基因的表达有关。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要英文缩略语

声明

第一部分：骨髓间充质干细胞的培养、标记及体内示踪

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第二部分 冠心Ⅱ号联合骨髓间充质干细胞移植对大鼠急性心肌梗死心功能和心肌纤维化的影响

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

4展望

5小结

参考文献

综述：心室重塑的研究进展

致谢