大鼠急性心肌梗死经5-氮胞苷诱导的骨髓间充质干细胞移植后Cx43/Cx45表达水平的研究

摘要

目的：探讨体外大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchyma stemcells，MSCs)的分离、纯化、扩增及5-氮胞苷(5-Aza)对MSCs诱导分化为心肌样细胞的作用；大鼠急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)模型的建立和经5-Aza作用的MSCs移植治疗后能否改善梗死心肌缝隙连接蛋白43(Cx43)、Cx45的异常表达。 方法：在无菌条件下分离Wistar大鼠股骨骨髓，采用密度梯度离心与贴壁培养法相结合进行MSCs培养、纯化和扩增。在获得稳定的细胞系后，选取生长良好的MSCs用不同浓度5-Aza分别作用不同时长，收集细胞行透射电镜观察并行α-肌动蛋白、Cx43、肌钙蛋白T的免疫细胞化学检测。Wistar大鼠180只，随机分为4组，每组45只：①正常对照组(Nor组)；②假手术组(Sham组)；③心肌梗死+生理盐水组(MI组)；④MSCs移植组(MSCs组)。采用开胸结扎冠状动脉左前降支(left anterior descending coronary artery，LAD)，术后10分钟即行心电图检查，S-T段呈弓背向上抬高，幅度超过0.2mV，伴R波振幅降低，认为AMI模型制作成功。成功存活7天并补齐的四组Wistar大鼠，按干预后4周、8周和12周又分为3个亚组，每亚组15只大鼠。MI组和MSCs组7天后二次开胸。MSCs组心肌梗死的边缘区和中心区植入诱导后的MSCs。MI组注射等量生理盐水。Sham组只开胸未行注射。于术后4周、8周和12周分别处死动物，取左心室组织在荧光显微镜下观察DAPI标记的供体细胞迁移、分布情况；同时取正常区、边缘区、梗死中心区心肌组织，-80℃保存。提取心脏组织蛋白行Western blotting测定Cx43、Cx45含量。 结果：Wistar大鼠MSCs经过分离、贴壁、纯化能在体外进行增殖并保持良好的未分化潜能。经10μmol/L5-Aza持续作用15天的MSCs，8周时呈现出心肌样细胞的典型改变，并有部分细胞出现自发搏动，频率为15-20次/分。电镜下可见大量糖原颗粒、线粒体和肌丝样结构。MSCs在体外DAPI标记率达100％，随着时间延长荧光强度逐渐减弱。干预后4周、8周、12周的Cx43在各组正常区含量均无差异(P均>0.05)。干预4周、8周、12周后，在MI组和MSCs组中，缺血区Cx43的含量均较正常区明显减少(P<0.01)；4周、8周、12周MSCs组缺血区Cx43的含量多于MI组缺血区(P<0.05)。各组梗死区Cx43的含量均较正常区减少。各组梗死区Cx43的含量均较缺血区明显减少(P<0.01)。干预后8周、12周MSCs组梗死区Cx43的含量多于MI组梗死区(P<0.05)。干预后4周、8周、12周Cx45含量在各组正常区无显著差异(P均>0.05)。干预后4周，在MI组中，缺血区的Cx45的含量表达多于正常区(P<0.01)。干预后8周、12周，MI组缺血区和正常区Cx45的含量无区别(P>0.05)；MSCs组缺血区Cx45的含量少于正常区(P<0.01)。干预后4周、8周、12周MSCs组缺血区Cx45的含量少于MI组(P<0.05)。各组梗死区的Cx45含量均较正常区减少(P<0.01)。4、8、12周MI组中梗死区Cx45含量少于缺血区(P<0.01)，8、12周MSCs组中梗死区Cx45的含量少于缺血区(P<0.01)。MI组和MSCs组比较，梗死区Cx45的含量无统计学差异。 结论：MSCs在体外有良好的增殖能力并保持其未分化潜能特性，MSCs经适宜浓度5-Aza诱导作用后可向心肌样细胞分化。AMI导致心肌Cx43、Cx45蛋白水平表达下降；经适宜浓度5-Aza诱导的同种异体MSCs移植能上调梗死区和缺血区Cx43的表达，下调缺血区Cx45的表达，对梗死区Cx45表达没有明显影响。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要英文缩写索引

声明

前言

第一部分大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及鉴定

材料

实验方法

结果

讨论

结论

第二部分5-氮胞苷体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化及鉴定

材料与方法

结果

讨论

结论

第三部分 急性心肌梗死大鼠移植骨髓间充质干细胞后心肌组织Cx43/Cx45表达的研究

一、急性心肌梗死大鼠模型的制作和骨髓间充质干细胞移植

材料与方法

结果

二、Western blot检测Cx43、Cx45的表达

材料与方法

结果

讨论

结论

全文总结

参考文献

综述 急性心肌梗死缝隙连接重构与干细胞移植治疗

致谢

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