短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白的亲和层析分离及药代动力学研究

摘要

目的：1.通过亲和层析法分离纯化短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白(PBAP)，简化原有的纯化步骤，并对其一些酶学性质进行研究。2.建立双抗体夹心-ELISA法测定家兔血清中短尾蝮蛇毒PBAP的浓度。根据血药浓度的变化，拟合房室模型及计算相关药动学参数，为进一步临床研究提供实验基础。
　　 方法：1.采用离子交换和凝胶过滤层析，分离纯化短尾蝮蛇毒PBAP并以此作抗原，免疫家兔制备多克隆抗体。用酶联免疫吸附(ELISA)-间接法测定抗血清效价，双向免疫扩散法测定抗体滴度，免疫印迹法鉴定特异性；成功制备兔抗PBAP血清后，通过硫酸铵沉淀法纯化多克隆抗体，利用溴化氰活化的Sepharose4B凝胶偶联抗体构建亲和层析柱，通过CM-SephadexC-25阳离子交换柱层析，CNBr-activatedSepharose4B亲和柱层析和SephacrylS-200凝胶过滤柱层析分离纯化PBAP。对纯化的PBAP进行酶学性质的测定，研究丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF、胰蛋白酶、抑肽酶、二价金属离子(Ca2+、Mg2+、Co2+、Mn2+、Zn2+)、温度、pH、金属络合剂EDTA对PBAP精氨酸酯酶活力的影响。2.利用纯化的短尾蝮蛇毒(PBAP)免疫家兔获得抗血清，经硫酸铵沉淀法纯化后用辣根过氧化物酶(HRP)标记，建立双抗夹心-ELISA法标准曲线，鉴定其灵敏度、精确度、回收率。用0.8、0.4mg·kg-1高低两组剂量的短尾蝮蛇毒PBAP对家兔进行耳缘静脉给药，给药后1、5、15、30、60、120、240、480min从家兔颈总动脉分别抽取2ml血液，4C静置至血清出现并将其收集。用双抗体夹心-ELISA法测定血药浓度，以此作为指标计算有关药代动力学模型及参数。
　　 结果：1.成功地制备了短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白多克隆抗体，酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗血清效价高达1∶12800，双向免疫扩散测定抗体滴度高达1∶32，免疫印迹法鉴定证明该抗体对磷脂结合抗凝蛋白具有专一性；利用多克隆抗体偶联溴化氰活化的Sepharose4B成功构建亲和层析柱，分离纯化得到PBAP；PMSF、胰蛋白酶对PBAP的精氨酸酯酶活力有抑制作用，抑肽酶、Ca2+、Mg2+、Co2+、Mn2+、Zn2+、EDTA对PBAP精氨酸酯酶无明显影响，温度在20～90℃，pH在4.0～11.0的条件下，PBAP的精氨酸酯酶可稳定存在。2.短尾蝮蛇毒PBAP多克隆抗体能与血清中PBAP特异性结合，双抗体夹心-ELISA法检测抗原的最小检出限为2.4ng·ml-1，标准曲线在0.0024～10μg·ml-1范围内线性良好。平均批内变异系数为7.96％，平均批间变异系数为10.94％，平均回收率为98.78％。给药组不同时间点血药浓度的数据经DAS2.0软件处理，高低两个剂量组的PBAP在家兔体内的药代动力学过程均符合二房室模型。高低剂量组主要药代动力学参数：分布相半衰期t1/2。分别为9.873±1.433min，13.053±4.668min(P＞0.05)；消除相半衰期t1/2β分别为205.798±76.834min，241.295±66.06min(P＞0.05)；曲线下面积AUC0-∞分别为61.625±11.631mg·L-1·min，27.114±2.781mg·L-1·min(P＜0.01)；清除率C1分别为0.014±0.003L·min-1kg-1，0.015±0.002L·min-1·kg-1(P＞0.05)。
　　 结论：1.成功地制备了短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白多克隆抗体，该抗体对磷脂结合抗凝蛋白具有专一性，利用亲和层析法分离纯化PBAP，具有简单、快速的优点。2.双抗体夹心-ELISA法具有良好的准确性、灵敏度和特异性，可用于短尾蝮蛇毒PBAP在家兔体内药代动力学的研究。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语

声明

前言

第一部分短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白的亲和层析分离及部分酶学性质研究

1材料与仪器

2实验步骤与方法

3结果

4讨论

5结论

参考文献

第二部分双抗体夹心-酶联免疫吸附法进行短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白药代动力学研究

1材料与仪器

2实验步骤与方法

3结果

4讨论

5结论

参考文献

全文总结

综述：酶联免疫吸附检测技术及其医药应用的发展

致谢

攻读学位期间已(待)发表的学术论文