线粒体Cx43预防兔心肌缺血/再灌注损伤作用机制的研究

摘要

缺血心肌再灌注过程中常易发生缺血再灌注损伤，心肌IRI是临床上常见的一种心肌损害现象，并且其机制复杂。目前心肌IRI保护的干预措施主要包括缺血预处理、药物预处理和缺血后处理，PC、IP和药物预处理等存在一些共同的保护机制。研究发现PC具有明显的心肌保护作用，但是其确切机理至今仍未完全阐明。近年来在体、离体的研究证实IRI早期引起Cx43脱磷酸化，缝隙连接开放，引起坏死物质的传播导致梗死加重。GJ参与IRI，以GJ为靶点的抗IRI药物可能是一个新的发展方向，Heptanol作为GJ的解耦联剂，在临床上有潜在运用价值。2005年Schulz等首次在心肌线粒体上发现缝隙连接蛋白43的表达，线粒体Cx43在IP中作用也成热点研究之一。新近研究提示心肌线粒体以及线粒体Cx43在心肌IRI损伤以及IP心肌保护中具有非常重要的作用。同时在IP心肌保护作用中线粒体ATP敏感钾通道参与GJ调控。
　　 本实验旨在探讨线粒体及线粒体Cx43是否参与PC和Heptanol的心肌保护作用及其可能机制。
　　 本研究建立兔心肌IRI模型，给予PC和Heptanol预处理，并应用5-羟葵酸即线粒体ATP敏感性钾通道特异性阻滞剂，观察PC和Heptanol对IRI兔心肌保护作用及线粒体Cx43在其中所起的作用。本课题共分为四个部分加以研究，即(1)PC及Heptanol预处理对兔IRI的影响；(2)PC及Heptanol预处理对兔IRI心肌细胞凋亡与线粒体结构及功能的影响；(3)PC及Heptanol预处理对兔IRI的细胞膜及线粒体Cx43影响；(4)mitoKATP和线粒体Cx43在缺血后处理和Heptanol预处理相关IRI中的作用。
　　 第一部分缺血后处理及Heptanol预处理对兔心肌缺血/再灌注保护作用
　　 目的：建立兔IRI模型，观察PC、Heptanol预处理对兔IRI的保护作用。
　　 方法：80只新西兰大白兔随机分为5组，雌雄不分，分别为假手术组、心肌缺血/再灌注模型组、缺血预处理组，缺血后处理组以及Heptanol预处理组。假手术组左冠状动脉前降支近端穿线但不结扎，观察4h，其余4组则结扎30min后，松开结扎线，予4h再灌注。分别于结扎前、结扎后30min、再灌注30min、再灌注2h、再灌注4h取颈动脉血测定血浆磷酸肌酸激酶同工酶，肌钙蛋白以及超氧化物歧化酶与丙二醛含量以及通过颈动脉插管测定上述5个时点的血流动力学指标。再灌注结束后，Even's和TTC染色法测心梗面积，HE染色观察各组心肌组织结构变化，电镜观察各组心肌细胞超微结构的变化。取心肌组织，制备匀浆液，测定SOD与MDA含量。
　　 结果：1.心肌酶学：与Sham组比较，其余各组CK-MB、cTnI值在结扎30min、再灌30min、再灌2h及再灌4h后明显升高。与IR组比较，IP组、PC组和HT组的CK-MB、cTnI值在再灌30min、再灌2h和再灌4h后均明显下降。2.血流动力学指标：各组术前均无差异。术后，与Sham组比较，各处理组结扎后30min、再灌注30min、再灌注2h、再灌注4h的HR、MAP、±dp/d tmax均明显降低，LVEDP明显升高，均有显著性差异；与IR组比较，IP、PC和HT组的MAP、±dp/d tmax和LVEDP各指标在再灌注2h、4h明显改善，有统计学意义。3.心梗面积：IP，PC和HT组的心梗面积明显小于IR组，差异有统计学意义。3.心肌组织结构的变化和心肌超微结构的变化：光镜与电镜显示结果，与Sham组比较，IR组心肌细胞损伤明显；与IR组比较，IP、PC和HT组心肌细胞损伤减轻明显。4.心肌组织匀浆及血清中SOD与MDA变化：缺血再灌注4h后，与Sham组比较，IR组SOD活性明显降低，MDA明显升高，差异有统计学意义。与IR组比较，IP和PC组SOD活性明显升高，MDA明显减低，差异有统计学意义；而HT组SOD与MDA活性改变无显著性差异。
　　 结论：PC与Heptanol预处理对兔心肌IRI的具有保护作用。
　　 第二部分缺血后处理、Heptanol预处理对兔心肌缺血/再灌注心肌细胞凋亡及线粒体结构、功能的影响
　　 目的：建立兔缺血再灌注模型，观察PC、Heptanol预处理对兔IRI心肌凋亡、线粒体结构及功能的影响。
　　 方法：80只新西兰大白兔随机分为5组，动物模型制备、分组及纳入例数均与第一部分相同。采用TUNEL法检测各组缺血心肌细胞凋亡，用透射电镜观察心肌线粒体的超微结构改变，同时检测线粒体膜电位、Ca2+浓度、丙二醛浓度、超氧化物岐化酶活性的改变。
　　 结果：与IR组比较，PC、HT和IP组兔心肌细胞凋亡减少，心肌线粒体形态结构改变明显减轻；线粒体跨膜电位明显升高、线粒体Ca2+浓度明显下降，差异有统计学意义；PC、HT和IP组比较差异无统计学意义。与IR组比较，HT组SOD与MDA改变差异无统计学意义；IP组和PC组SOD活性明显升高、MDA浓度均下降，差异有统计学意义。
　　 结论：PC、Heptanol可能通过提高线粒体跨膜电位、减轻线粒体钙超载以致改善缺血再灌注心肌细胞损伤、减轻心肌凋亡；PC可降低线粒体氧自由基水平，而与PC心肌保护机制不同的是，HT不能降低线粒体氧自由基水平。
　　 第三部分缺血后处理、Heptanol预处理对兔心肌缺血/再灌注损伤中细胞膜及线粒体Cx43的影响
　　 目的：探讨PC、Heptanol对兔IRI中细胞膜及线粒体Cx43的影响。
　　 方法：兔80只，建立心肌IRI模型，随机分5组，每组16只：假手术组、缺血再灌注组、缺血预处理组、缺血后处理组和Heptanol预处理。应用电镜观察各组闰盘结构变化；应用免疫组化、免疫荧光法检测细胞膜Cx43-GJ分布及含量变化；采用差速离心法提取各组缺血区心肌线粒体蛋白，应用Western blot检测线粒体Cx43蛋白含量。进一步从转录水平采用RT-PCR检测Cx43mRNA表达。
　　 结果：(1)闰盘结构变化与Sham组比较，IR组闰盘及GJ结构不清，可见移位、断裂。与IR组比较，IP、PC和HT组的闰盘病变明显减轻。(2)细胞膜Cx43、GJ与Sham组比较，IR组GJ重构明显，胞膜Cx43含量明显减少。与IR组比较，IP、PC和HT组的GJ重构明显减轻，并且胞膜Cx43含量增加。(3)线粒体Cx43蛋白与Sham组比较，IR组线粒体Cx43蛋白显著下降；与IR组比较，PC组、HT组和IP组心肌线粒体Cx43明显升高。
　　 结论：PC、Heptanol预处理可以减轻IRI引起的闰盘损伤、细胞膜和线粒体Cx43的减少及改善GJ重构，细胞膜与线粒体Cx43可能参与了PC和Heptanol预处理的心肌保护作用。
　　 第四部分线粒体ATP敏感钾通道和线粒体Cx43在缺血后处理和Heptanol预处理相关缺血/再灌注损伤中的作用
　　 目的：探讨线粒体ATP敏感钾通道和线粒体Cx43在PC和Heptanol保护兔IRI中的作用。
　　 方法：兔112只，建立IRI模型，随机分7组，每组16只：假手术组、缺血再灌注组、缺血后处理组和Heptanol预处理、缺血后处理组+5HD组和Heptanol预处理+5HD组。假手术组左冠状动脉前降支近端穿线但不结扎，观察4h，其余4组则结扎30min后，予4h再灌注。取血测定结扎前、结扎后30min、再灌注30min、再灌注2h、再灌注4h血浆CK-MB、cTnI以及SOD与MDA含量。实验结束后，Even's和TTC染色法测心梗面积。电镜观察心肌细胞超微结构尤其是线粒体与闰盘结构的变化。TUNEL法检测缺血心肌细胞凋亡。免疫荧光检测胞膜cx43-GJ变化以及胞膜Cx43含量，差速离心法提取线粒体，并检测线粒体膜电位、Ca2+浓度、MDA浓度、SOD活性的改变。应用Western Blot检测线粒体Cx43蛋白含量。进一步用RT-PCR检测心肌组织中Cx43mRNA改变。
　　 结果：再灌注4h末，IP、PC和HT组的血浆CK-MB、cTnI及心梗面积明显低于IR、PC+5HD和HT+5HD组。与IR、PC+5HD和HT+5HD组比较，IP、PC和HT组兔心肌细胞凋亡减少，心肌、闰盘及线粒体形态结构改变明显减轻，线粒体跨膜电位、SOD活性明显升高，线粒体Ca2+浓度、MDA浓度均下降。免疫荧光检测细胞膜Cx43、GJ及Western Blot检测线粒体Cx43蛋白发现，与Sham组比较，IR、PC+5HD和HT+5HD组细胞膜与线粒体Cx43蛋白显著下降；与IR组比较，PC、HT、IP、PC+5HD和HT+5HD组心肌胞膜和线粒体Cx43明显升高。与PC+5HD和HT+5HD组比较，IP、PC和HT组胞膜Cx43及线粒体Cx43蛋白明显升高。
　　 结论：PC、Heptanol预处理可以减轻IRI引起的闰盘损伤、改善GJ重构、减轻IRI所致的细胞膜及线粒体Cx43的含量，其可能通过提高线粒体跨膜电位、减轻线粒体钙超载、改善缺血再灌注心肌细胞凋亡等来达到对兔IRI的保护作用。细胞膜、线粒体Cx43可能参与了PC和Heptanol预处理的心肌保护作用，其机制与mitoKATP有关。PC也可降低线粒体氧自由基水平。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:主要英文缩写索引

声明

前言

第一部分 缺血后处理、Heptanol预处理对兔心肌缺血/再灌注的保护作用

实验材料

实验方法

结果

讨论

结论

附图

附表

参考文献

第二部分 缺血后处理、Heptanol预处理对兔心肌缺血/再灌注心肌细胞凋亡、线粒体结构及功能的影响

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

结论

附图

附表

参考文献

第三部分 缺血后处理、Heptanol预处理对兔缺血/再灌注心肌细胞与线粒体Cx43的影响

实验材料

实验方法

结果

讨论

结论

附图、表

参考文献

第四部分 线粒体ATP敏感钾通道和线粒体Cx43在缺血后处理和Heptanol预处理相关缺血再灌注损伤中的作用

实验材料

实验方法

结果结果

讨论

结论

附图

附表

参考文献

全文总结

综述 线粒体Cx43研究进展及它的心血管作用

主要试剂配制

附在读博士期间发表的论文、摘要、课题以及获奖情况

致谢