SHR大鼠肥厚左室心肌microRNA表达与室性心律失常关系的研究

摘要

microRNA(miRNA)是内源性非编码蛋白质的单链小RNA，它通过调控基因表达来参与生命过程中的一系列重要进程。有研究表明miRNA可能与疾病发生有密切的关系，在不同类型疾病的发生过程中，miRNA的表达水平及其调节作用是不同的。已有研究发现miRNA与心肌肥厚、心律失常等心血管疾病的发生发展密切相关。动物实验研究表明，大鼠心肌梗死后miRNA-1的表达上调抑制心肌连接蛋白43(connexin43，Cx43)和内向整流钾通道2.1(Kir2.1)的表达而引发室性心律失常(VA)。
　　 高血压病是常见的心血管疾病，长期的血压增高可导致左室肥厚(LVH)。已有临床研究表明，高血压病伴LVH患者VA的发生率可数倍增高，甚至可发生猝死。目前有关高血压心肌肥厚发生VA的机制尚未完全阐明。因此，为了进一步阐明高血压LVH者发生VA的分子机制，寻找新的VA治疗靶点，本研究以SHR大鼠为研究对象，进行了以下三方面的系列研究。
　　 第一部分：SHR大鼠LVH与VA诱发的实验研究。
　　 17周龄的雄性SHR大鼠12只为LVH组，8周龄的雄性SHR大鼠12只为非LVH组，17周龄的雄性WKY大鼠12只为对照组。通过Langendorff灌注大鼠的离体心脏，观察低钾液灌注诱发VA的情况；组织病理学染色观察离体心脏LVH情况。结果发现：1、HE染色结果显示LVH组大鼠左心室心肌细胞明显肥大，心肌间质有不同程度增多。2、LVH组灌注低钾液后出现VA时间明显早于非LVH组和对照组(P＜0.01，P＜0.05)。3、LVH组的心律失常评分、VT发生率明显高于非LVH组和对照组(P＜0.05)。
　　 第二部分：SHR大鼠肥厚左室心肌组织中miRNA表达的研究。本部分包括二个方面的研究：1、SHR大鼠肥厚左室心肌组织中miRNA差异表达研究。2、实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测SHR大鼠肥厚左室心肌组织miRNA-1表达。
　　 在SHR大鼠肥厚左室心肌组织中miRNA差异表达的研究中，10只16周龄雄性SHR大鼠为LVH组，10只8周龄雄性SHR大鼠为对照组。左室质量指数(LVMI)、组织病理学染色和测量心肌细胞横径(TDM)方法观察LVH状况；取左心室心肌组织常规抽提总RNA，应用含有924条探针的miRNA芯片检测系统进行miRNA表达谱差异分析。结果发现：1、与对照组比较，LVH组和非LVH组的收缩压和舒张压明显增高(P＜0.05，P＜0.01)。2、HE染色结果显示LVH组大鼠左室心肌呈肥大表现，心肌间质有不同程度增多；与对照组比较，LVH组大鼠LVMI和CVF明显增高(P＜0.05)。3、LVH组大鼠左室心肌组织miRNA表达谱中差异表达的miRNA共有13个，其中有4个miRNA上调，9个miRNA下调。
　　 在RT-PCR检测SHR大鼠肥厚左室心肌组织miRNA-1表达的研究中，通过RT-PCR法定量检测第二部分(研究一)大鼠心肌组织miRNA-1表达水平。结果发现：1、与对照组比较，LVH组左室心肌组织miRNA-1表达水平明显升高为对照组的2.08±0.21倍。2、SHR大鼠左室心肌组织miRNA-1表达水平与LVMI、CVF均呈正相关(分别r=0.712和0.674，均P＜0.05)。
　　 第三部分：miRNA-1对心肌组织Cx43、Kir2.1的调控作用研究。分为两方面的研究：1、SHR大鼠肥厚左室心肌组织中Cx43、Kir2.1表达及其与miRNA-1相关性研究。2、干预SHR大鼠肥厚左室心肌组织中miRNA-1的表达对Cx43、Kir2.1蛋白表达水平的影响。
　　 在SHR大鼠肥厚左室心肌组织中Cx43、Kir2.1表达及其与miRNA-1相关性研究中，取第二部分两组大鼠心肌组织，用免疫组织化学和WesternBlot检测心肌组织中Kir2.1和Cx43蛋白表达。结果发现：LVH组左室心肌组织Cx43、Kir2.1相对含量均明显低于对照组(均P＜0.05)，并且与心肌组织miRNA-1表达水平均呈显著负相关(均P＜0.05)。
　　 在干预SHR大鼠肥厚左室心肌组织中miRNA-1的表达对Cx43、Kir2.1水平的影响研究中，选择16只高血压持续发展期并有LVH的17周龄SHR大鼠作为研究对象，随机分为干预组6只，空白对照组和阴性对照组各5只。采用尾静脉高压注射脂质体瞬时转染miRNA-1抑制剂(Anti-mRNA-1)技术基因沉默miRNA-1。结果发现：1、与两个对照组比较，干预组转染Anti-miRNA-1后大鼠左室心肌组织miRNA-1表达水平明显减少了(40±8％，P＜0.05)。2、转染Anti-miRNA-1基因沉默miRNA-1使干预组大鼠左室心肌组织Cx43、Kir2.1蛋白表达水平明显高于阴性对照组和空白对照组(均P＜0.05)。
　　 本课题研究结果表明：1、伴有LVH的SHR大鼠心脏低钾灌注液诱发VA几率明显增高，提示LVH与VA的发生密切相关。2、SHR大鼠肥厚的左室心肌组织miRNA的表达有明显改变，提示miRNA可能参与SHR大鼠高血压左室肥厚的发生发展。3、SHR肥厚左室大鼠心肌组织中miRNA-1表达明显上调，并与LVMI、CVF呈正相关。4、SHR大鼠肥厚左室心肌组织Cx43、Kir2.1表达下调，并与心肌组织miRNA-1表达水平呈显著负相关。5、抑制miRNA-1表达能使SHR肥厚左室心肌组织Cx43和Kir2.1蛋白表达水平升高，提示miRNA-1可能通过抑制Cx43和Kir2.1蛋白表达而参与SHR大鼠左室肥厚时VA的发生。

目录

文摘

英文文摘

声明

前 言

第一部分SHR大鼠LVH与VA诱发的实验研究

第二部分SHR大鼠肥厚左室心肌组织中miRNA表达的研究

研究一SHR大鼠肥厚左室心肌组织中miRNA差异表达研究

研究二实时荧光定量PCR检测SHR大鼠肥厚左室心肌组织miRNA-1表达

第三部分miRNA-1对心肌组织连接蛋白43、内向整流钾通道2.1的调控作用

研究一 SHR大鼠肥厚左室心肌组织中Cx43、Kir2.1表达及其与miRNA-1相关性研究

研究二干预SHR大鼠肥厚左室心肌组织中miRNA-1的表达对Cx43、Kir2.1水平的影响

全文总结

本课题的创新点

参考文献

附录 中英文缩略词对照表

综述：microRNA与心血管疾病

致谢

攻读博士学位期间撰写的文章