绿原酸联合两性霉素B对烟曲霉菌生物被膜干预作用及其机制的体外研究

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述：
　　第一部分 绿原酸联合两性霉素B对烟曲霉菌生物膜干预作用的体外研究
　　目的：探讨金银花主要活性成分绿原酸及其联合两性霉素B对烟曲霉生物膜的体外作用。
　　方法：以临床分离筛选并鉴定为形成生物膜能力最强的4号烟曲霉菌株（编号为A.f004）为受试菌株，体外构建早期(24h)、成熟期(48h)静止生物膜模型;实验分为无药的阳性对照组、AMB组、CRA组和CRA+AMB组;二倍稀释法测定各药物的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀真菌浓度(MFC);结晶紫染色法(CV)测定生物膜的量;XTT减低法测定生物膜内真菌细胞的代谢活力;激光扫描共聚焦显微镜(CSLM)观察药物作用后生物膜内菌丝细胞的死活情况，扫描电镜(SEM)观察生物膜的形态。
　　结果：A.f004经孵育24h、48h后可稳定形成生物膜。生物膜定量结果显示:各实验组药物作用48h后，无论是早期还是成熟期，单独AMB组的生物膜量与空白对照组相比，差异均无统计学意义（P＞0.05），而单独CRA作用的生物膜量均较空白组和AMB组减少，差异有统计学意义（P＜0.05)，且绿原酸联合两性霉素B作用后，生物膜量则进一步减少（P＜0.05）。生物膜代谢活力测定显示:与空白组相比，单独的AMB组和CRA组生物膜内真菌代谢活力无明显改变，各组间差异均无统计学意义(P＞0.05)，而CRA+AMB组较空白组和AMB组明显下降(P＜0.05)。扫描电镜观察早期和成熟期生物膜形态，可见单独AMB作用组与无药对照组生物膜形态无明显改变，而单独的绿原酸作用后，与无药阳性对照组相比，胞外基质明显减少，与AMB联合作用后，胞外基质和菌丝均减少，残存菌丝干瘪;激光共聚焦观察早期及成熟期的生物膜死活菌，可见单独CRA和AMB作用组几乎均为绿色的活菌，而CRA+AMB联合作用组则大部分菌丝死亡，以带有红色荧光的死菌为主，菌丝减少，生物膜结构松散。
　　结论：烟曲霉菌在体外培养24h、48h后可稳定形成早期和成熟期的生物膜;金银花主要活性成分绿原酸对烟曲霉菌生物膜细胞无杀菌作用，但可以破坏早期和成熟期的生物膜结构，与AMB联合作用后可以增强AMB对生物膜内菌体的杀菌作用。
　　第二部分 绿原酸对烟曲霉菌生物膜干预作用机制的体外研究
　　目的：探讨金银花主要活性成分绿原酸对烟曲霉菌生物膜形成过程中疏水蛋白基因、外排泵基因及唑类药物靶酶基因的影响。
　　方法：以临床分离的A.f004为实验菌株，分为无药阳性对照组、不同浓度梯度的CRA组(128μg/ml、256μg/ml、512μg/ml、1024μg/ml);RT-PCR测定烟曲霉菌生物膜形成过程中疏水蛋白基因(RODA、ROD)B、RODC、RODD、RODE、RODF)，外排泵基因(AfuMDR1、AfuMDR2、AfuMDR3、AfuMDR4、atrF)及唑类药物靶酶基因(CYP51A、CYP51B)的相对表达量。
　　结果：烟曲霉菌生物膜疏水蛋白基因表达水平测定结果示:受试浓度范围(128～1024μg/ml)的CRA作用后，疏水蛋白基因RODA表达均明显下调，与空白组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）;浓度为256μg/ml、512μg/ml、1024μg/ml的CRA作用后，疏水蛋白基因RODB,RODC,RODD,RODE和RODF的表达水平均较无药对照组减少，差异有统计学意义(P＜0.05);在浓度为128μg/ml的CRA作用后，RODB、RODD、RODE表达水平亦轻度下调，与无药对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）;各疏水蛋白基因在随着CRA浓度的增加时抑制表达作用更明显，其中在高浓度的CRA作用下RODA基因的抑制表达作用最明显。绿原酸对烟曲霉生物膜药物外排泵基因干预作用结果显示:药物外排泵基因AuMDR、AfuMDR2、AfuMDR3、AfuMDR4及atrF在较高浓度的CRA（512μg/ml和1024μg/ml）作用下表达水平均下调，其差异有统计学意义（P＜0.05），且抑制表达随着CRA浓度增高而增强;在CRA浓度为1024μg/ml，AuMDR3抑制表达最明显;256μg/ml的CRA也可下调AfuMDR2、AfuMDR3表达，与空白组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。浓度为512μg/ml和1024μg/ml的CRA均可以抑制唑类药物靶酶基因CYP51A、CYP51B表达，与对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)，其中CYP51A下调作用更明显（P＜0.01），且在浓度为256μg/ml的CRA作用后，CYP51B基因表达不受影响，而CYP51A表达仍受抑制，与对照组相比，有统计学差异（P＜0.05)。
　　结论：亚抑菌浓度的绿原酸可以抑制烟曲霉菌生物膜疏水蛋白基因、外排泵基因及唑类靶酶基因的表达，且呈浓度依赖性抑制作用。

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摘要

前言

第一部分 绿原酸联合两性霉素B对烟曲霉菌生物膜干预作用的体外研究

材料和方法

结果

讨论

第二部分 绿原酸对烟曲霉菌生物膜干预作用机制的体外研究

材料和方法

结果

讨论

全文总结

参考文献

综述

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