PP2A在微囊藻毒素-LR诱导的肝细胞早衰中的作用研究

摘要

微囊藻毒素(Microcystins，MCs)是由富营养化水体中的铜绿微囊藻、水华鱼腥藻、颤藻等产生的一组具有肝脏毒性的单环多肽毒素。目前已知有90多种异构体，微囊藻毒素-LR(MC-LR)是其中分布最广、毒性最强的一种异构体。研究表明，MC-LR可以通过主动转运的方式进入肝细胞导致细胞氧化损伤。它能抑制真核细胞丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶PP1和PP2A的活性，引起蛋白磷酸化水平升高。细胞衰老(cellular senescence)是指细胞进入稳定不可逆转的细胞周期停滞状态，并被免疫系统清除的过程。细胞衰老分为复制型衰老（replicative senescence）和早衰，前者是因细胞复制过程中端粒耗损产生，而细胞早衰(cellular premature senescence)是细胞受到DNA损伤、缺氧或代谢应激，抑或肿瘤基因激活引起的衰老，除了出现细胞周期停滞外，还分泌大量的细胞因子，引起免疫清除。细胞早衰是细胞水平上对抗DNA损伤的重要机制，在衰老、退行性疾病以及肿瘤发生发展中起着重要作用。目前，国内外对MC-LR引起DNA损伤以及细胞凋亡的研究较多，但MC-LR是否能诱导细胞早衰尚未有文献报道。于是本研究采用人胚肝细胞系L-02(L-02肝细胞)，探讨微囊藻毒素-LR是否能诱导L-02肝细胞发生早衰及其作用机制。
　　目的:
　　建立微囊藻毒素-LR(MC-LR)诱导的L-02肝细胞早衰模型，初步探索PP2A在MC-LR诱导肝细胞早衰过程中的作用及其分子机制。
　　方法:
　　L-02肝细胞在含10％胎牛血清及100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI-1640培养基中，置37℃，5％ CO2条件下培养。将处于对数生长期的细胞随机分为:对照组(0.2％ DMSO);10 nmol/L D-神经鞘氨醇（D-erythro-sphingosine，DES）处理组，给予DES作用细胞12h;20μmol/LMC-LR染毒组;DES拮抗组，即给予10 nmol/L DES预处理12h后，再进行MC-LR（20μmol/L）染毒。染毒细胞3周后，采用CCK-8（Cell CountingKit-8）法检测细胞增殖水平;衰老相关β-半乳糖苷酶(Senescence associatedβ-Galactosidase，SA-β-Gal)染色法检测细胞早衰的发生;采用基于碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染色的流式细胞术检测细胞周期;细胞经二脒基-苯基吲哚(Diamidino Phenylindole，DAPI)染色后，采用激光共聚焦显微镜观察细胞核中的衰老相关异染色质凝集(Senescence-Associated HeterochromaticFoci，SAHF)的分布情况;采用以磷肽为底物的染色法检测PP2A酶活性;提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，用实时荧光定量PCR法检测细胞周期调控基因p21、p16、Gadd45α的mRNA表达水平。
　　结果:
　　(1)染毒3周后，MC-LR组细胞活力明显低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05);DES拮抗组的细胞活力稍高于MC-LR染毒组，但差异尚未达到显著性水平（P＞0.05）。
　　(2)与对照组相比，MC-LR染毒3周后SA-β-gal染色阳性细胞数明显增多，差异有统计学意义(P＜0.05)。DES拮抗组SA-β-gal染色阳性细胞数明显低于MC-LR染毒组，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　(3)与对照组相比，MC-LR染毒组3周后G0/G1期细胞所占比例增高，S期细胞所占比例下降，差异均有统计学意义（P＞0.05）。DES拮抗组G0/G1期细胞所占比例低于MC-LR染毒组（P＞0.05）。
　　(4) MC-LR染毒3周后，对照组与MC-LR染毒组均未见SAHF形成。
　　(5)染毒3周后，MC-LR染毒组的PP2A活性明显低于对照组，为对照组的55.07％;而DES拮抗组的PP2A活性明显上升，为MC-LR染毒组的1.43倍，差异均有统计学意义(P＜0.05)。
　　(6)染毒3周后，MC-LR染毒组的p21、p16、Gadd45α的mRNA表达水平分别提高至对照组的4.16、1.57、2.12倍，差异均有统计学意义(P＜0.05)。而DES拮抗组的p21、p16 mRNA表达水平则低于MC-LR染毒组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论:
　　(1) MC-LR可诱导L-02肝细胞发生早衰，表现为细胞增殖减缓、细胞周期G1期阻滞和β-半乳糖苷酶活性升高。
　　(2) MC-LR所致早衰细胞中PP2A酶活性降低，细胞周期调控基因p21、p16、Gadd45α的转录水平明显升高，而PP2A激活剂DES可抑制MC-LR诱导的肝细胞早衰和细胞周期阻滞，提示PP2A、p21和p16可能参与MC-LR诱导的肝细胞早衰过程。

目录

声明

个人简历

缩写词汇中英对照表

摘要

前言

1 材料与方法

2 结果

2．1 MC-LR对L-02肝细胞增殖的影响及DES的干预作用

2．2 MC-LR对L-02肝细胞SA-β-Gal活性的影响及DES的干预作用

2．3 MC-LR对L-02肝细胞周期分布的影响及DES的干预作用

2．4 DAPI染色观察衰老相关异染色质凝集(SAHF)形成

2．5 MC-LR对L-02肝细胞PP2A酶活性的影响及DES的干预作用

2．6 MC-LR对L-02肝细胞p21、p16、Gadd45α mRNA表达的影响及DES的干预作用

3 讨论

参考文献

综述

致谢

攻读学位期间发表的学术论文