慢性硫酸锰染毒对大鼠海马组织PI3K/Akt信号通路及Hsp70的影响

摘要

目的：通过建立大鼠慢性硫酸锰染毒模型，观察大鼠血浆氧化应激指标及Hsp70含量的变化，同时观察海马组织凋亡相关基因和Hsp70基因表达的变化、海马组织PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达及磷酸化的改变以及Hsp70蛋白的表达量，研究MnSO4诱发神经凋亡可能的机制以及对PI3K/Akt信号通路的影响，并探讨Hsp70作为慢性锰中毒的生物标志物的可行性。
　　方法：选择健康雄性SPF级SD大鼠40只，随机分成四组：空白对照组、低剂量组（5mg/kg）、中剂量组（10mg/kg）、高剂量组（20mg/kg），每组10只，分笼饲养，自由饮水、摄食。分别腹腔注射生理盐水、5、10、20 mg/kg的MnSO4?H2O溶液染毒24周，每周五次，周末休息两天。在染毒第24周后颈椎脱臼处死大鼠，收集大鼠生物样本并称重，计算脏器系数；使用南京建成生物工程研究所试剂盒检测大鼠血浆SOD、GSH-Px、CAT及MDA水平，ELISA试剂盒检测血浆Hsp70含量；分离大鼠海马组织，荧光定量PCR法测定海马组织Caspase-3、Bcl-2、Bax、Akt-1、FoxO3a、Hsp70 mRNA表达水平，Western Blot法测定Hsp70蛋白表达及Akt蛋白表达及其磷酸化水平。
　　结果：
　　（1）随着染锰浓度的增加，大鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏及肾脏脏器系数均随之升高，睾丸脏器系数随之明显下降。经统计学分析，高剂量组大鼠肝脏、脾脏、肺脏及肾脏脏器系数均显著高于对照组与低剂量组（P<0.05），心脏系数显著低于中剂量组（P<0.05），睾丸脏器系数显著低于其余三组（P<0.05）；中剂量组及低剂量组大鼠脾脏脏器系数显著高于对照组（P<0.05）。
　　（2）慢性硫酸锰染毒大鼠高剂量组血浆SOD、GSH-Px及CAT活力分别为(135.46±35.41) U/ml、(845.81±26.06) U及(3.06±0.42) U/ml，均显著低于对照组（P<0.01）及低剂量组（P<0.05）。高剂量组大鼠血浆MDA浓度为(3.05±0.37) nmol/L，显著高于对照组的(2.53±0.21) nmol/L（P<0.01）及低剂量组的(2.61±0.35) nmol/L（P<0.05）。高剂量组染毒大鼠血浆Hsp70含量为(1020.50±134.86) ng/ml，显著高于对照组的(807.15±160.23) ng/ml（P<0.05）及低剂量组的(830.64±161.02) ng/ml（P<0.05）。
　　（3）大鼠海马组织Akt-1、FoxO3a mRNA表达量随染毒剂量增加而降低（P<0.05）；高剂量组Hsp70 mRNA表达量显著高于对照组、低剂量组及中剂量组，差异均具有统计学意义（P<0.05）。高剂量组caspase-3及Bcl-2 mRNA表达量显著低于低剂量组（P<0.05），但Bax mRNA表达量则显著高于对照组及低剂量组（P<0.05）。
　　（4）Western Blot实验结果显示，随着硫酸锰染毒剂量增加，各组间海马Akt蛋白表达量无统计学差异（P>0.05），但Akt（pS473）表达量呈上升趋势（P<0.05）。随着硫酸锰染毒剂量增加，海马Hsp70蛋白含量呈增加趋势，高剂量组Hsp70蛋白含量显著高于对照组（P<0.05）与低剂量组（P<0.05）。
　　（5）Pearson相关性分析结果显示，大鼠血浆Hsp70含量与血浆SOD、CAT以及GSH-Px活力呈负相关性，相关系数分别为r1=-0.4439，r2=-0.4516，r3=-0.5226，差异均具有统计学意义（P<0.05）；血浆Hsp70含量与血浆MDA含量呈显著正相关性（r4=0.4785，P<0.05）。血浆Hsp70含量与海马组织Hsp70蛋白表达量成正相关，相关系数为r5=0.7415（P<0.05）。
　　结论：
　　（1）慢性MnSO4染毒可能通过引起大鼠体内抗氧化能力下降，脂质过氧化水平升高，从而造成中枢神经细胞损伤及凋亡增加。
　　（2）慢性MnSO4染毒可以激活大鼠海马PI3K/Akt通路，促进Akt转录因子磷酸化，Hsp70表达相应增加。
　　（3）慢性MnSO4染毒可以引起大鼠海马Hsp70含量增加，并与血浆Hsp70含量呈显著正相关。提示Hsp70可考虑作为慢性MnSO4暴露的效应性生物标志物。

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1 前 言

2 材料与方法

2.1 主要仪器和试剂

2.2 动物实验

2.3 外周血氧化应激水平测定

2.4 大鼠血浆Hsp70含量的测定（ELISA试剂盒）

2.5 RT-PCR检测各基因的mRNA表达

2.6 Western Blot实验

2.7 数据统计分析

3 结果

3.1 慢性硫酸锰锰染毒对大鼠体重及一般情况的影响

3.2 慢性硫酸锰染毒对大鼠脏器系数的影响

3.3 慢性硫酸锰染毒对大鼠外周血氧化应激的影响

3.4慢性硫酸锰染毒对凋亡相关基因表达的影响

3.5慢性硫酸锰染毒对PI3K/Akt通路的影响

3.6慢性硫酸锰染毒对Hsp70的影响

3.7 相关性分析

4 讨论

4.1 慢性硫酸锰染毒与氧化应激

4.2 大鼠慢性硫酸锰染毒对PI3K/Akt通路的影响

4.3 大鼠慢性硫酸锰染毒对Hsp70的影响

4.4 慢性硫酸锰染毒与大鼠神经细胞凋亡

5 结论

5.1 研究结论

5.2 研究的创新点

5.3 研究的不足与展望

参考文献

综述:热休克蛋白70功能研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文