人类唾液腺组织片新型培养模型的建立

摘要

目的:在人类唾液腺体的研究进程中，如何在完全体外环境下维持唾液腺体细胞的三维（3D）形态结构一直以来都是个难题。本研究的目的在于建立一个新型的人类唾液腺组织培养模型和并维持组织片在体外环境下的生理功能，蛋白和基因表达。通过该模型的建立，使唾液腺组织片能够在体外环境下保留组织内环境及细胞的多样性，使我们有机会将该模型运用于唾液腺相关的生理和病理学研究中，从而探讨人类唾液腺体相关疾病的发病机理。
　　方法:总共选取6个人类唾液腺体标本,供者年龄在34至75岁之间。将唾液腺组织片切至35～50μm厚度后进行培养。我们共使用了7种方法来对组织片培养过程中各项指标进行评估。
　　首先，在不同培养时间点上，通过细胞生存/死亡染色、细胞增殖染色及细胞凋亡染色分别检测细胞存活率、增殖能力和凋亡率，从而评估细胞生理性能。所有结果都通过共聚焦显微镜协助完成。
　　功能评估方面，定量检测α淀粉酶活性以及钙离子释放活力从而评估培养过程中腺泡细胞的分泌功能。
　　最后通过免疫荧光（IF）染色和实时定量基因扩增荧光检测系统（q PCR）分别检测人类唾液腺组织片中各项蛋白和基因表达。IF染色检测的蛋白为Na+- K+-2Cl-钠钾氯共转运蛋白（NKCC1）、水通道蛋白5（AQP5）、角蛋白5（CK5）及α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）。q PCR使用磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH，管家基因）作为内参基因，NKCC1、AQP5、CK5和钙黏蛋白为目地基因。
　　我们总共观察培养过程中的4个时间点，分别为0、3、7和14天，并对每个时间点的组织标本做以上7种检测。
　　结果：在本研究建立的培养系统中，人类腺体组织片能够成功的在体外进行培养。人类唾液腺组织经过14天的培养后，存活率虽然从第0天的70％下降至第14天的40%，但仍可证明唾液腺细胞得以留存超过两周。细胞增殖率维持在6%至17%之间，甚至在培养的中后期出现了上升趋势，可证明细胞及组织片的增殖能力同样得以存留。淀粉酶活性定量检测表明在14天的培养过程里，组织片中功能细胞（腺泡细胞）仍然保留了一定的分泌功能。钙离子释放检测的阳性结果同样证明组织片仍具备唾液腺体生理功能。我们能够通过IF及q PCR检测到腺泡细胞，导管细胞，肌上皮细胞的蛋白和基因标志物的表达，说明腺泡细胞，导管细胞和肌上皮细胞都成功的存活于本研究所建立的3D组织片培养模型中。
　　结论：通过持续14天的观察和评估，结果表明本研究所建立的培养系统可成功的培养人类SG组织片，所培养的腺体组织可以保持重要的生理功能。通过本实验建立的培养模型，使我们可以在后续的研究中进一步探讨受到放射线辐射后的唾液腺组织的损伤病程，并为探究更有效治疗唾液腺损伤的方法提供研究模型。

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中文摘要

英文摘要

前言

实验一：人类唾液腺体组织片培养模型的建立

1、材料与方法

2、结果

3、讨论

实验二：在人类SG组织片培养的模型中组织片的形态学与组织学变化

1、材料与方法

2、结果

3、讨论

实验三：人类SG在组织片培养模型中的功能以及其相关表达的改变

1、材料与方法

2、结果

3、讨论

结论

参考文献

附录英文缩略语表

文献综述: 三维（3D）培养概述及其在唾液腺研究中的应用

致谢

攻读学位期间发表的学术论文