POLD3在胃腺癌中的表达及临床意义分析

摘要

目的：胃腺癌（gastric adenocarcinoma，GAC）属于消化道恶性上皮性肿瘤，目前发病率仍高居我国男性恶性肿瘤第二位，死亡率为男性恶性肿瘤患者的前三位。DNA聚合酶δ（DNA polymerase delta，POLD）是真核细胞DNA聚合酶B族中的一员，广泛参与生物体内DNA的复制及损伤修复过程，其第三亚基（DNA polymerase delta3，POLD3）作为POLD的辅助亚基，在POLD参与的各项生命活动中均处于核心地位。目前在对POLD3与癌症的关系研究中，能够明确的是POLD3的突变体增加结直肠癌的发病风险、卵巢癌预后不良患者中POLD3的表达下调，但其与胃癌的关系暂未见报道。本课题通过免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）、蛋白印迹（western blotting，WB）、实时定量多聚酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-q PCR）、体外细胞学等技术检测GAC组织与胃腺癌细胞系中POLD3的表达水平，分析了POLD3表达对GAC增殖、分化及预后等影响。
　　方法：⑴收集2005年1月至2008年12月期间在右江民族医学院附属医院住院的经病理确诊的、接受了根治性手术切除的GAC临床I-II期病例；收集所有研究对象的手术切除石蜡标本和适量新鲜组织用于POLD3表达分析；同时，收集所有研究对象的相关临床病理资料及生存随访资料，随访截止日期至2014年12月。⑵使用IHC检测POLD3蛋白在GAC肿瘤组织及肿瘤旁组织的表达情况，通过t检验分析POLD3在肿瘤组织与肿瘤旁组织间的表达差异；使用卡方检验、非条件Logistic回归方法分析肿瘤组织中POLD3表达与GAC临床病理特征的关系；通过Kaplan-Meier法绘制生存曲线并计算中位生存期（Median survival time，MST），通过多因素风险比例回归模型计算POLD3对GAC总体死亡风险值。⑶使用RT-q PCR技术检测POLD3 mRNA在10例肿瘤组织与肿瘤旁组织的表达情况，通过t检验比较分析POLD3 mRNA在肿瘤组织与肿瘤旁组织间的表达差异。⑷常规培养2株人胃腺癌细胞系及1株人非肿瘤胃黏膜上皮细胞株，通过WB和RT-q PCR分别检测各培养细胞系中POLD3蛋白和mRNA的表达水平。⑸通过分子克隆技术检测分析体外过表达POLD3对GAC细胞增殖的影响。
　　结果：①当前研究共收集到符合要求的TNM分期为I-II期的GAC患者共82例，男性和女性分别为58例（70.7％）和24例（29.3%），平均年龄53.17?11.19岁，其中早期胃癌4例（4.9%），进展期胃癌78例（95.1%），高分化者或中分化者占65.9%（54/82）、低或未分化者占34.1（28/82）。②与肿瘤旁组织相比，POLD3蛋白在GAC肿瘤组织中表达水平减少（P=4.26?10-14）；体外细胞学实验有相似发现。③与肿瘤旁组织相比，POLD3 mRNA在GAC肿瘤组织中表达水平减少（P=8.00?10-6）；体外细胞学实验有相似发现（P=7.20?10-5）。④与低POLD3表达者相比，高POLD3表达者其肿瘤组织分化程度更高，对应贡献值为5.00(1.35?-18.48)，P值为0.016；体外细胞学实验有相似发现。⑤POLD3表达影响胃腺癌肿瘤大小，肿瘤直径较大者，肿瘤组织中POLD3蛋白表达水平较低，Logistic回归分析表明高POLD3表达者，抑制肿瘤生长的贡献值为5.78（1.55-21.51），对应P值为0.009。⑥POLD3表达影响体外培养胃腺癌细胞增殖，与空载或空白对照相比，低POLD3表达的MKN-45细胞株在接受了POLD3过表达载体后，其生长速度明显受到抑制（P<0.05）。⑦POLD3表达水平影响胃腺癌患者的预后：高和低表达对应中位总体生存期分别为34和16个月（P<0.01），低POLD3表达者其总体死亡风险为高表达者2.43倍（可信区间为1.25-4.71）。
　　结论：POLD3在GAC肿瘤中表达下调，这种下调与肿瘤分化、增殖及不良预后均相关。

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前言

材料与方法

1.主要材料与试剂

2.主要仪器

3.研究对象

4.细胞系与细胞培养

5.载体构建

6.免疫组织化学

7 蛋白免疫印迹

8 POLD3 mRNA检测技术

9.细胞增殖分析

10.统计学处理

1. 研究对象的基本特征

2. POLD3蛋白在胃腺癌中的表达情况

3. POLD3 mRNA在胃腺癌中的表达情况

4. POLD3表达与胃腺癌肿瘤分化的关系

5. POLD3表达对胃腺癌增殖的影响

6. POLD3表达对胃腺癌患者预后的影响

讨论

参考文献

综述： DNA聚合酶delta研究进展

致谢

攻读研究生期间发表的学术论文目录

附录1主要中英文缩写对照

附录2 国际抗癌联盟/美国癌症联合委员会（UICC/AJCC）胃癌TNM分期第七版

附录3 胃癌的各种分类方法