Sirt1修饰间充质干细胞对前列腺癌生长的影响及机制研究

摘要

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)作为一种主要来源于骨髓且具有多向分化潜能的干细胞近年来受到了人们的广泛关注。由于MSCs具有免疫调节的特性，近年来，临床上多将其应用为治疗免疫性相关疾病的一种方法。另外，MSCs还具有向炎症创伤组织以及肿瘤组织定向趋化的能力，曾作为抗癌药物载体而被广泛而大量地研究。然而，随着研究的进一步深入，人们发现MSCs在特定肿瘤微环境中可能对肿瘤的增殖起促进作用，进而加速肿瘤的发生发展进程，这就大大限制了MSCs在肿瘤治疗中作用的发挥。这一点在我们的前期研究中也得到证实，MSCs对前列腺癌的进展发挥着重要的推动作用。因此，寻找到一种可以有效利用MSCs向肿瘤组织趋化这一特性同时使其抑制肿瘤进展的方式就显得格外重要。也正是基于这一目的，我们设计了这个课题，希望可以探索出一条以MSCs为生物载体，使其迁移至肿瘤组织表达特定细胞因子从而发挥抗肿瘤效应，从而更有效地对肿瘤进行治疗。
　　近年来，一种叫做沉默信息调节因子2相关酶1(Silent mating typeinformation regulation2 homolog1，Sirt1)的组蛋白去乙酰化酶进入了科研学者的视线。作为目前研究最多最深入的SIRTs(Silent information regulatortwo proteins)组蛋白去乙酰化酶家族成员基因，Sirt1已经被大量研究表明在调节各种生物学功能，例如衰老、代谢、DNA损伤以及肿瘤发生发展的过程中发挥着重要的作用。并且有证据表明Sirt1在人前列腺癌组织中的表达明显上调，且在前列腺癌的侵袭进展过程中占据重要角色。然而当MSCs过表达Sirt1后其对肿瘤发生发展的影响至今仍无相关研究。立足于这一点，我们进行了相关的探索。
　　我们建立小鼠前列腺癌皮下移植瘤模型，将C57BL/6来源的前列腺癌细胞系RM-1细胞进行C57BL/6小鼠的腋窝皮下移植作为对照组，观察经与未经Sirt1修饰的MSCs与RM-1细胞共同移植到小鼠皮下所形成肿瘤体积与重量的差异。结果显示，未经Sirt1修饰的MSCs与RM-1细胞共同移植形成的皮下肿瘤较对照组体积明显增大，重量明显增加，而经Sirt1修饰的MSCs与RM-1细胞共同移植形成的皮下肿瘤较对照组生长缓慢，体积明显缩小，重量明显减小。我们对实验末留取的小鼠血清进行了筛选，发现经Sirt1修饰的MSCs与RM-1细胞共同移植组小鼠血清中IFN-γ的浓度明显高于其他各组。因此我们推测经Sirt1修饰的MSCs与RM-1细胞共同移植导致小鼠体内发生了强烈的炎症反应，接下来我们又对各组小鼠的肿瘤组织进行了流式细胞学检测，发现肿瘤组织中NK细胞的含量差异显著。其中，未经Sirt1修饰的MSCs与RM-1细胞共同移植组的肿瘤组织NK细胞数量低于对照组，而经Sirt1修饰的MSCs与RM-1细胞共同移植组的肿瘤组织NK细胞数量明显高于对照组。随后我们对各组NK细胞的杀伤活性进行了检测，发现在不同效靶比下，经Sirt1修饰的MSCs与RM-1细胞共同移植组NK细胞的杀伤活性远高于其他各组，且随着效靶比的升高而不断增强。
　　为了进一步验证经Sirt1修饰的MSCs与RM-1细胞共同移植组NK细胞和炎症细胞因子IFN-γ在抑制肿瘤生长中的决定性作用，我们进行了抗体中和实验。实验结果表明，在经Sirt1修饰的MSCs与RM-1细胞共同移植组小鼠体内，无论NK细胞还是炎症细胞因子IFN-γ被中和后，均可引起肿瘤重量和体积的增加，使得原本的抑瘤效应大大降低。
　　基于上述结果我们不由设想，经Sirt1修饰的MSCs与RM-1细胞共同移植所形成的肿瘤组织内一定存在某种物质可以定向地趋化大量NK细胞进而发挥免疫杀伤肿瘤细胞的作用，从而抑制肿瘤的生长。因此，我们检测了各组小鼠血清以及肿瘤组织趋化因子的表达，发现经Sirt1修饰的MSCs与RM-1细胞共同移植组小鼠血清以及肿瘤组织趋化因子10(CXC motifchemokine10，CXCL10)表达较其他各组明显升高。体外实验也证实，经Sirt1修饰的MSCs相对于未经Sirt1修饰的MSCs体外培养上清可检测到大量的CXCL10。我们不由推测经Sirt1修饰的MSCs分泌的CXCL10对NK细胞向肿瘤组织的定向趋化产生了至关重要的作用。为了验证我们的推测，我们进行了相应的体内外实验。体外实验显示，经Sirt1修饰的MSCs相较于未经Sirt1修饰的MSCs对NK细胞的趋化作用明显增强，而当对经Sirt1修饰的MSCs产生的CXCL10进行中和后，其对NK细胞的趋化作用则大大减弱。体内实验显示，当对小鼠体内CXCL10进行中和后，经Sirt1修饰的MSCs体内抑瘤效应受到极大削减，肿瘤体积和重量较前明显增大。我们进一步对肿瘤组织NK细胞数量进行了流式细胞学检测，结果显示当CXCL10被中和后，经Sirt1修饰的MSCs与RM-1细胞共同移植形成的肿瘤组织NK细胞数量较前大大降低，较其他各组无明显差异。综合以上结果，我们的推测得到了证实。
　　我们的研究结果表明，经Sirt1修饰的MSCs可以抑制前列腺癌细胞在小鼠体内的生长，机制可能是由于经Sirt1修饰的MSCs可以大量分泌CXCL10进而募集更多的NK细胞，增强IFN-γ介导的对肿瘤细胞的免疫杀伤作用，进而抑制肿瘤细胞生长。本研究从基础研究出发，探索MSCs经Sirt1修饰后对小鼠前列腺癌细胞生长的影响，希望可以为前列腺癌的治疗探索出新的方向。

目录

声明

个人简历

摘要

前言

第一部分 Sirt1修饰骨髓间充质干细胞对小鼠前列腺癌生长的影响

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第二部分 经Sirt1修饰骨髓间充质干细胞抑制小鼠前列腺癌生长的机制研究

1 材料与方法

2 实验方法

3 结果

4 讨论

结论

参考文献

附录

综述 间充质干细胞在肿瘤发生发展中的作用

致谢

攻读学位期间发表的学术论文