启动子区甲基化对肝癌细胞miRNA-214表达及细胞增殖活性的影响

摘要

目的:研究肝癌细胞株miRNA-214启动子区的甲基化状态。在不同浓度下，甲基转移酶抑制剂对其启动子区甲基化及miRNA-214的影响，进一步分析该RNA甲基化抑制对肝癌细胞系增殖的影响。
　　方法:运用生物信息学在线软件预测miRNA-214启动子区域及CpG位点;提取LO-2、Huh7、HepG2和QSG-7701四种肝细胞株DNA，通过亚硫酸氢盐测序法(bisulfite-sequencing PCR，BSP)分析该mi-RNA CpG位点的甲基化;使用0 umol/L，5umol/L和10umol/L三种不同浓度的甲基转移酶抑制剂(5-Aza-CdR)干扰肝细胞株启动子区甲基化，并通过RT-PCR方法检测不同浓度处理组的mi RNA-214表达;通过细胞增殖实验检测以上三种浓度下抑制剂对肝细胞增殖的影响。
　　结果:
　　(1)根据BSP计算，miRNA-214启动子区甲基化频率，未处理组结果显示，LO-2、Huh7、HepG2和QSG-7701四种肝细胞的启动子区甲基化程度分别为51.42％、80.00％、60.00％和68.57％。与正常肝细胞(LO-2)比较，肝癌细胞(Huh7、HepG2和QSG-7701)的miRNA-214启动子区甲基化程度均明显升高，差异有明显差异(F=25.9，p＜0.001)。
　　(2)经PCR检测，未处理组4种肝细胞(LO-2、Huh7、HepG2和QSG-7701)的miRNA-214表达量分别为2.84±0.52、1.00±0.08、1.00±0.06和1.00±0.12。与正常肝细胞比较，三种肝癌细胞的miRNA-214表达水平较低，结果具有统计学意义(F=35.39，p＜0.001)。在5umol/L和10umol/L两种浓度下，处理组四种肝细胞miRNA-214表达水平分别为1.66±0.06、0.58±0.12、0.73±0.13和0.83±0.04;1.00±0.29、0.34±0.07、0.10±0.01和0.30±0.06。随着干扰素浓度升高，四种肝细胞的miRNA-214表达水平降低。三个递增浓度处理组比较，miRNA-214表达具有统计学意义(F=21.9，p＜0.001; F=40.5, p＜0.001; F=98.1,p＜0.001; F=61.6, p＜0.001)。
　　(3)细胞增殖实验中，未处理组4种肝细胞系(LO-2、Huh7、HepG2和QSG-7701)增殖水平分别为0.18±0.03、0.81±0.61、0.68±0.28和3.79±0.16;在5μmol/L和10μmol/L浓度下，处理组肝细胞(LO-2、Huh7、HepG2和QSG-7701)增殖水平为0.17±0.07、1.14±0.76、0.42±0.18和2.70±0.107;0.16±0.04、1.55±0.87、0.37±0.19和0.45±0.37。与正常肝细胞比较，Huh7细胞经去甲基化处理后细胞增殖活性增加(F=72.89，p＜0.05)，HepG2细胞和QSG-7701经去甲基化处理后细胞增殖活性略降低(F=95.36，p＜0.05;F=381.46，p＜0.05)，差异具有统计学意义。
　　结论:通过BSP计算，我们发现3种肝癌细胞均呈现miRNA-214启动子区高甲基化。经不同浓度甲基化转移酶抑制剂干扰处理，肝癌细胞miRNA-214启动子区甲基化显著下降， miRNA-214表达水平降低，但是促进了肝癌细胞增殖。我们的结果证实，DNA甲基化可调控肝癌细胞中miRNA-214的表达，进一步影响肝癌的进展。

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英文缩略词索引

摘要

前言

一、材料与方法

1 实验材料

1．1 主要仪器设备

1．2 细胞

1．3 主要试剂

1．4 常用试剂的配制

1．5 生物信息学分析

2 实验方法

2．1 启动子区域的生物信息学分析

2．2 细胞培养

2．3 miRNA-214启动子区甲基化水平检测

2．4 miRNA-214的定量检测

2．5 细胞增殖活性检测

3 统计学处理

二、结果

1 启动子区域的生物信息学分析

1．1 CpG岛位置

1．2 BSP引物

1．3 基因组DNA的提取结果

2 启动子CpG位点甲基化状态分析

3 甲基转移酶抑制剂对启动子甲基化的影响

4 5-Aza-CdR对不同肝细胞系miRNA-214表达水平的影响

5 5-Aza-CdR对不同肝细胞系细胞增殖的影响

三、讨论

1．去甲基化对miRNA-214启动子区甲基化程度的分析

2．去甲基化对miRNA-214表达水平的分析

3．去甲基化对细胞增殖活性的分析

4 问题与展望

四、结论

参考文献

综述 miRNA与DNA甲基化在肝细胞癌中的作用

致谢

攻读学位期间发表及待发表的文章