菲牛蛭对载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化的影响

摘要

目的：
　　本文选用ApoE基因敲除(apolipoprotein E gene knock out，ApoE-/-)小鼠作为研究对象。旨在讨论菲牛蛭对ApoE-/-小鼠血脂水平以及动脉粥样硬化斑块内相关蛋白和基因的表达，以探讨菲牛蛭抗动脉粥样硬化的可能机制。
　　方法：
　　本文选用15周龄雄性ApoE-/-小鼠高脂饲料喂养5周建立动脉粥样硬化的小鼠模型。后将ApoE-/-小鼠随机分为模型组Mol(n=8)、为菲牛蛭粉高剂量组HPH(200mg.kg-1.d-1，n=8)、菲牛蛭粉低剂量组HPL(75mg.kg-1.d-1，n=8)、辛伐他汀组Sim(3mg.kg-1.d-1，n=8)、菲牛蛭素高剂量组BDH(400U.kg-1.d-1，n=8)、菲牛蛭粉低剂量组BDL(200U.kg-1.d-1，n=8);C57BL/J6作为空白对照组Con(control group，n=8)，给药时间为10周。10周后检测实验指标如下:
　　1.测定各组小鼠的血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的水平;
　　2.通过HE染色，观察各组小鼠主动脉根部粥样硬化斑块情况;
　　3.通过Masson染色，观察各组小鼠主动脉根部粥样硬化斑块内胶原含量情况;
　　4.运用免疫组化半定量法检测各组小鼠主动脉内CD34、VEGF、VEGFR-2、HIF-1α的蛋白表达情况
　　5、运用实时定量RT-PCR检测各组小鼠主动脉中的VEGF、HIF-1α和VEGFR-2mRNA表达情况。
　　结果：
　　血脂水平结果显示:与模型组相比，辛伐他汀组、菲牛蛭粉大剂量组、菲牛蛭粉小剂量组、菲牛蛭素大剂量组、菲牛蛭素小剂量组均能降低小鼠中TC、TG、LDL-C的水平（P＜0.05或者P＜0.01）。而与模型组相比，菲牛蛭粉大剂量组、菲牛蛭粉小剂量组、辛伐他汀组能升高HDL-C水平(P＜0.05或者P＜0.01)而菲牛蛭素大剂量组、菲牛蛭素小剂量组能降低HDL-C水平(P＜0.05)。
　　(1)HE染色结果显示管腔内的病理结构，模型组中出现血管壁增厚，出现大量坏死组织、泡沫细胞，形成斑块。与模型组相比，各个治疗组以上斑块情况均有改善。
　　(2)Masson染色结果显示:各组斑块中胶原含量分别为21.5±2.44％（模型组）、51.7±2.47％（菲牛蛭素大剂量组）、45.9±4.12％（菲牛蛭素小剂量组）、37.7±3.33％（辛伐他汀组）、31.6±4.80％（菲牛蛭粉大剂量组）、26.0±2.10％（菲牛蛭粉小剂量组），与模型组比较各个治疗组均有统计学差异(P＜0.01)
　　(3)CD34免疫组化结果显示:与正常对照组相比较，模型组与各个治疗组中的CD34含量均高于对照组(P＜0.01);与模型组相比，各个治疗组中的CD34含量均明显减少（P＜0.05或者P＜0.01）.菲牛蛭粉大剂量组与菲牛蛭粉小剂量组间有显著差异(P＜0.05)
　　(4) VEGF免疫组化结果显示:与正常对照组相比较，模型组与各个治疗组中的VEGF含量均高于对照组(P＜0.01);与模型组相比，各个治疗组中的VEGF含量均明显减少（P＜0.05或者P＜0.01）;菲牛蛭素大剂量组和菲牛蛭素小剂量组之间有显著差异(P＜0.05);菲牛蛭粉大剂量组、菲牛蛭粉小剂量组间有显著差异(P＜0.05)
　　(5) VEGFR-2免疫组化结果显示:与正常对照组相比较，模型组与各个治疗组中的VEGF含量均高于对照组(P＜0.01);与模型组相比，各个治疗组中的VEGF含量均明显减少(P＜0.01);
　　(6) HIF-1α免疫组化结果显示:与正常对照组相比较，模型组与各个治疗组中的HIF-1α含量均高于对照组(P＜0.01);与模型组相比，各个治疗组中的HIF-1α含量均明显减少(P＜0.01);菲牛蛭素大剂量组和菲牛蛭素小剂量组之间有显著差异(P＜0.01);菲牛蛭粉大剂量组与菲牛蛭粉小剂量组之间无明显差异(P＞0.05)
　　(7) RT-PCR结果显示，VEGF mRNA表达比较:与正常对照组相比，模型组小鼠血管壁VEGF mRNA表达显著升高(P＜0.01);与模型组相比，各药物干预组血管壁VEGR mRNA表达均明显下降(P＜0.01)
　　(8) RT-PCR结果显示，VEGFR-2mRNA表达比较:与正常对照组相比，模型组小鼠血管壁VEGFR-2mRNA表达显著升高(P＜0.01);与模型组相比，各药物组血管壁VEGFR-2mRNA表达均明显下降(P＜0.01)
　　(9) HIF-1α mRNA表达比较:与正常对照组相比，模型组小鼠血管壁HIF-1α mRNA表达显著升高(P＜0.01);与模型组相比，各药物组血管壁HIF-1α mRNA表达均明显下降(P＜0.01);其中菲牛蛭素大剂量组下降最为显著(P＜0.01);辛伐他汀组表达均低于菲牛蛭粉大剂量组和菲牛蛭粉小剂量组(P＜0.01)
　　结论：
　　1、菲牛蛭能够降低ApoE-/-小鼠的血脂水平。
　　2、菲牛蛭能抑制动脉粥样硬化斑块形成，增加斑块内胶原，增加动脉粥样硬化斑块的稳定性，其中菲牛蛭素效果明显。
　　3、菲牛蛭能抑制动脉粥样硬化斑块中的血管新生，抑制血管新生相关基因VEGFmRNA、VEGFR-2mRNA、HIF-1α mRNA以及相应蛋白的表达。

目录

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个人简历

中英文缩略词表

摘要

一、前言

第一部分 菲牛蛭对载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块及血管的影响

1、实验材料

2、实验方法

3、实验结果

3．1 动脉粥样硬化模型的建立

3．2 各实验组血脂水平的比较

3．3 HE染色及斑块形态观察

3．4 masson染色及斑块内胶原纤维含量的测定

3．5 CD34免疫组化检测结果

4、讨论

5、结论

参考文献

第二部分 菲牛蛭对载脂蛋白基因敲除小鼠主动脉中血管新生相关蛋白和基因的研究

1、实验材料

2、实验方法

3、实验结果

3．1 VEGF免疫组化检测结果

3．2 VEGFR2免疫组化检测结果

3．3 HIF-1α免疫组化检测结果

3．4 RT-PCR产物扩增曲线与溶解曲线分析

3．5 VEGFmRNA表达水平结果

3．6 VEGFR2mRNA表达水平结果

3．7 HIF-1α mRNA表达水平结果

4、讨论

5、结论

参考文献

综述 动脉粥样硬化的研究进展

致谢

攻读学位期间发表的学术论文