EB病毒感染与鼻咽癌细胞钙结合蛋白S100A8、S100A9上调机制的研究

摘要

本文包括三个部分：（一）构建EB病毒感染的鼻咽癌细胞系与S100A8、S100A9蛋白的检测；（二）携带绿色荧光报告基因的EBV-LMP1、EBV-LMP2A真核表达质粒的构建；（三）LMP1、LMP2A质粒在鼻咽癌细胞中表达及对S100A8、S100A9的影响。
　　第一部分构建EB病毒感染的鼻咽癌细胞系与S100A8、S100A9蛋白的检测
　　目的：探讨S100A8、S100A9在鼻咽癌组织和细胞中的表达上调是否与EBV的感染有关，EBV的潜伏感染是否是S100A8、S100A9表达上调的原因？
　　方法：①采用共培养的方式，B95-8狨猴淋巴瘤细胞与鼻咽癌细胞接触使无EBV感染的鼻咽癌细胞感染EBV。在感染EBV后利用免疫细胞毒性反应杀灭B95-8细胞，建立携带EBV的CNE1-E、CNE2-E细胞株。②根据EBV在鼻咽癌中存在的时间，人为划分感染的时期。③通过流式细胞术对CNE1-E、CNE2-E进行周期检测并用HE染色观察细胞形态变化。④根据细胞克隆形成实验观察感染后细胞克隆形成能力。⑤CCK-8检测EBV感染后鼻咽癌细胞抗5-Fu（IC50浓度）的能力。⑥qRT-PCR检测感染EBV后鼻咽癌细胞中S100A8、S100A9、MMPs的mRNA表达情况。⑦Western-blot验证S100A8、S100A9蛋白的表达。⑧qRT-PCR检测CNE1-E、CNE2-E细胞中S100A8、S100A9高表达时期LMP1蛋白的mRNA表达情况。
　　结果：①细胞数（1:1）共培养后，B淋巴细胞瘤与鼻咽癌细胞相互接触，在杀灭B95-8细胞后剩余细胞呈现上皮细胞状，PCR检测EBV特异性基因BamHI-W呈阳性和狨猴特异性基因CAJA呈阴性，说明EBV成功感染鼻咽癌细胞，并且没有B95-8细胞的残留。②利用PCR检测感染后的EBV在细胞中的存在时间大约在20±5天。③对于不同分化的鼻咽癌细胞，EBV感染后存在不同的周期变化，CNE1-E首先出现G0/G1期减少、S期+G2期增加，随着时间的递延，G0/G1期逐渐增加、S期+G2期逐渐减少，表现出先增殖后抑制的趋势。而CNE2-E细胞首先出现G0/G1期增加、S期+G2期减少，随着时间的递延，G0/G1期逐渐减少、S期+G2期逐渐增加，表现出先抑制后增殖的趋势。在感染的后期可以明显的观察到细胞中染色质加粗等细胞增殖的特征。④CNE1-E、CNE2-E细胞的平板克隆形成能力均高于CNE1、CNE2细胞（P＜0.05）。⑤感染后72h，CNE1-E与CNE1相比有较强的抗5-Fu作用（P＜0.05），而CNE2-E则与CNE2无明显差异（P＜0.05）。⑥在CNE1-E、CNE2-E细胞中，S100A8、S100A9的mRNA表达均有上调，但随时间的变化，基本表现出先增加后减少的趋势，其中CNE2-E中的S100A8、S100A9表现出先减少后逐渐增加的趋势。⑦Western-blot的结果与qRT-PCR的结果基本一致。⑧在S100A8、S100A9表达上调时期，LMP1蛋白的mRNA表达呈阳性，S100A8、S100A9的表达可能与EBV的潜伏感染有关。
　　结论：①EBV感染鼻咽癌细胞后可引起S100A8、S100A9的表达上调，感染后EBV所处的时期与S100A8、S100A9的表达有密切的关系。②S100A8、S100A9蛋白的表达上调通常会出现在EBV的潜伏感染期。第二部分携带绿色荧光报告基因的EBV-LMP1、EBV-LMP2A真核表达质粒的构建
　　目的：为验证S100A8、S100A9的表达上调是否与EBV-LMP1、EBV-LMP2A的表达有关奠定实验基础。
　　方法：①提取B95-8细胞的总RNA逆转录为cDNA。②利用特异性引物扩增调取LMP1和LMP2A的mRNA序列，并且构建含有LMP1、LMP2A序列的亚克隆，PCR和测序验证。③将测序无误的序列经限制性内切酶剪切后定向克隆到携带绿色荧光报告基因的真核表达pIRES2-Zs-Green1载体中，构建pIRES2-Zs-Green1-LMP1和pIRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表达质粒。
　　结果：①从B95-8细胞的RNA中成功克隆并获得了LMP1、LMP2A序列。②测序后与NCBI数据库中的LMP1、LMP2A序列比对发现本实验室保藏的B95-8细胞来源的LMP1基因存在6处突变（136位G＞A，202位A＞C，253位A＞C，317位T＞A，691位G＞T，703位C＞T），但由于密码子的简并性翻译出的氨基酸序列与NCBI一致，LMP2A基因与NCBI数据库一致。③成功将LMP1和LMP2A定向插入pIRES2-Zs-Green1真核表达质粒中，PCR验证及测序验证无误。
　　结论：获得了携带绿色荧光报告基因的pIRES2-Zs-Green1-LMP1和pIRES2-Zs-Green1-LMP2A真核表达质粒。
　　第三部分LMP1、LMP2A质粒在鼻咽癌细胞中的表达及对S100A8、S100A9的影响。
　　目的：为验证S100A8、S100A9的表达上调是否与EBV的潜伏感染有关，特别是EBV潜伏感染期的两个重要蛋白LMP1和LMP2A是否参与调控鼻咽癌细胞内的S100A8、S100A9蛋白。
　　方法：①利用脂质体转染的方式将pIRES2-Zs-Green1-LMP1、pIRES2-Zs-Green1-LMP2A质粒转入鼻咽癌细胞中，使鼻咽癌细胞中表达LMP1蛋白、LMP2A蛋白以及共表达LMP1、LMP2A蛋白，根据载体本身携带的绿色荧光表达强度判断转染效率。②使用RT-PCR、WB、ICC等方法对LMP1、LMP2A的表达进行检测。③提取转染LMP1、LMP2A及LMP1和LMP2A共转染组的鼻咽癌细胞总RNA，qRT-PCR检测S100A8、S100A9蛋白的mRNA和基质金属蛋白酶MMP2、MMP3、MMP7、MMP9的mRNA表达。
　　结果：①CNE1细胞中，单转染LMP1或LMP2A质粒并不能使S100A8、S100A9表达上调，只有同时转染LMP1、LMP2A质粒时，S100A8、S100A9基因才出现表达上调（P＜0.05）；CNE2细胞中，单转染LMP1即可上调S100A8、S100A9基因的表达（P＜0.05），共同转染LMP1和LMP2A质粒可上调S100A9（P＜0.05），S100A8基因表达上调但差异不明显（P＞0.05）。②CNE1中在S100A8、S100A9上调表达的同时，MMP2、MMP3、MMP9基因表达上调（P＜0.05），CNE2在S100A8、S100A9上调表达的同时，MMP3和MMP7基因表达上调（P＜0.05）。
　　结论：①S100A8、S100A9的表达上调与EBV潜伏期编码的LMP1、LMP2A蛋白有关。③S100A8、S100A9在上调的同时金属基质蛋白酶家族也发生变化，不同分化期的鼻咽癌细胞MMPs的变化有所不同，低分化的CNE1细胞在S100A8、S100A9表达上调时更倾向于表达凝胶酶水解酶类的MMP2、MMP9，而高分化的CNE2细胞在S100A8、S100A9表达上调时更倾向于表达MMP3、MMP7等细胞基质酶。

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前言

1．研究目的

2. 研究内容

第一章构建EB病毒感染的鼻咽癌细胞系与S100A8、S100A9蛋白的检测

一、 材料和方法

二、结果与分析

三、讨论

第二章EBV-LMP1、EBV-LMP2A真核表达质粒的构建

一、 材料和方法

二、结果与分析

三、讨论

第三章LMP1、LMP2A质粒在鼻咽癌细胞中表达及对S100A8、S100A9蛋白的影响

一、 材料和方法

二、结果与分析

三、讨论

讨论与展望

综述:吸烟介导的炎-癌模式与鼻咽癌发生发展

附 录一

附 录二

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文