黄精多糖通过GSK-3β/β-catenin信号通路促进成骨细胞分化的机制研究

摘要

背景与目的:骨质疏松症(OP)是一种老年退化性全身骨科疾病，主要特点为骨密度降低及骨微结构破坏，易导致发生骨折，常见脊柱、髋和桡骨三个部位。随着全球老年化社会到来，骨质疏松症已被列为仅次于心血管疾病的第二大危害人类健康的慢性疾病。骨质疏松性骨折是一种可预防和治疗的疾病，充分认识老年骨质疏松症，早期预防和治疗对骨质疏松症并发症的发生有积极的临床意义。当前临床上治疗骨质疏松症的常用药物从功能上分为两种:促进骨形成和抑制骨吸收类药物，具有费用大、并发症多及治疗效果不佳等缺点，社会迫切需要开发经济和副作用少的新抗骨质疏松药物。天然植物化合物黄精多糖是药食同源的黄精提取物，前面的研究发现黄精多糖具有增强免疫力、抗肿瘤和抗衰老等功能。前期的研究发现，黄精多糖通过促进β-catenin蛋白进入细胞核激活经典Wnt信号通路下游促进小鼠骨髓间充质干细胞矿化，其具体分子机制仍不明确。本文探讨黄精多糖通过GSK-3β/β-catenin通路促进BMSCs向成骨细胞分化及其作用机制的研究。
　　方法:
　　(1) BMSCs的分离及培养，镜下观察小鼠骨髓间充干细胞增殖和生长情况;
　　(2) shRNA-LRP5病毒转染BMSC细胞，设置三组MOI=20，40，60，倒置荧光显微镜下观察CON组、NC组及shRNA-LRP5组绿色荧光蛋白(GFP)表达;
　　(3) Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测对shRNA-LRP5病毒转染BMSCs细胞增殖的影响；
　　(4)重组慢病毒shRNA-LRP5转染小鼠骨髓间充质干细胞，嘌呤霉素筛选一周后，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测LRP5基因表达及蛋白印迹法(WB)检测LRP5蛋白表达，检测shRNA-LRP5病毒转染BMSC细胞沉默效率;
　　(5)成骨诱导液诱导14天、21天后，使用qRT-PCR分别检测shRNA-LRP5组、Con组及NC组中的BMSCs中促进成骨相关的标志基因(ALP、Runx2、OCN)的基因表达水平，酶联免疫吸附测定法(ELISA法)检测成骨相关标志蛋白表达;
　　(6) shRNA-LRP5组、Con组及NC组分别加入成骨诱导液含PBS缓冲液、黄精多糖及Wnt3a诱导21天后，碱性磷酸酶染色(ALP染色)鉴定BMSCs转化成骨细胞，碱性磷酸二酯酶检测试剂(PNP比色法)检测碱性磷酸酶活性;诱导28天后，茜素红染色（ARS）鉴定成骨细胞矿化及茜素红染色定量检测矿物结节;
　　(7) TOPflash/FOPflashdual-luciferase report gene(双荧光素酶报告系统检测，TOPFLASH和阴性对照FOPFLASH)检测检测β-catenin在细胞核内作为转录因子的活性;
　　(8)western blot(WB)检测细胞总p-GSK-3β、GSK-3β蛋白及细胞核内β-catenin蛋白表达。
　　结果:
　　(1)提取的骨髓基质细胞呈贴壁生长，细胞生长状态良好和增殖能力强，成骨诱导液诱导后可向成骨细胞分化，成骨细胞形态表现为梭形或纤维样细胞。
　　(2)病毒转染BMSCs后转染96小时，细胞状态良好，显微镜下可见表达绿色荧光蛋白的BMSCs占总细胞的90％以上。
　　(3) CCK-8法检测shRNA-LRP5病毒转染BMSCs细胞增殖的影响，shRNA-LRP5、Con及NC组三组比较OD值无统计学差异。
　　(4)与Con组比较，qRT-RCR及Western blot检测shRNA-LRP5病毒转染BMSCs细胞沉默效率都达到70％以上，NC组表达水平没有明显下降。
　　(5) shRNA-LRP5组、Con组及NC组加入成骨诱导液分别诱导14天、21天后，使用qRT-RCR分别检测成骨基因的相对基因表达水平，ELISA法检测成骨相关标志蛋白表达水平，shRNA-LRP5与Con和NC组比较，具有统计学意义;Con和NC组比较无统计学差异。
　　(6)碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性检测、茜素红染色及茜素红染色定量检测结果:在Con组及NC组中，黄精多糖、Wnt3a都具有促进成骨作用，黄精多糖、Wnt3a诱导比较，无统计学差异;shRNA-LRP5组中，只有加入黄精多糖治疗组具有促进成骨作用，黄精多糖与Wnt3a、 PBS缓冲液诱导比较，差异具有统计学意义，Wnt3a与PBS缓冲液诱导比较，数据无统计学差异。
　　(7)与PBS缓冲液对比，Wnt3a处理后，Lueiferase活性检测发现Con、NC组中TOPFLASH活性增强，而shRNA-LRP5组中转录活性没有增高，黄精多糖处理后，转录活性显著增强。
　　(8)在Con组、shRNA-LRP5组中，与PBS缓冲液诱导比较，25mg/L黄精多糖促进BMSC细胞核内β-catenin蛋白表达;p-GSK-3β总蛋白组间差异具有统计学意义，而GSK-3β总蛋白比较无统计学差异。
　　结论:
　　(1)慢病毒介导的LRP5基因有效沉默小鼠骨髓间充干细胞的LRP5mRNA和蛋白，沉默LRP5基因阻止BMSCs成骨细胞分化。
　　(2)黄精多糖诱导LRP5基因敲除小鼠骨髓间充干细胞向成骨细胞分化，通过磷酸化BMSC细胞内糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)蛋白浓度，导致GSK-3β蛋白失去活性，细胞核内β-catenin蛋白浓度增多及提高Tcf/Lef介导的转录活性，促进BMSCs成骨细胞分化。

目录

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个人简历

本文主要中英文缩写对照

摘要

第一部分 慢病毒载体介导LRP5基因沉默对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

前言

1 材料及方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 统计学分析

1．4 结果

1．5 讨论

1．5 小结

第二部分 黄精多糖通过GSK-3β／β-catenin信号通路促进小鼠骨髓间质干细胞成骨分化

前言

2 材料及方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 统计学分析

2．4 结果

2．5 讨论

2．6 结论

参考文献

综述 Wnt／β-catenin信号通路在骨质疏松症的研究进展

致谢

攻读学位期间发表的学术论文