寨卡病毒感染小鼠动物模型的建立及其应用

摘要

寨卡病毒(ZIKV)属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)，病毒颗粒呈球形，直径为40-70nm，有包膜的单股正链RNA病毒，分为亚洲和非洲两个基因型。目前，在南美地区流行的病毒基因型是亚洲型。埃及伊蚊为寨卡病毒的主要传播媒介。2015年以来，寨卡疫情在全球多地肆虐，特别是南美洲、中北美洲及加勒比海地区疫情严重，且疫情至今不断发展，呈现蔓延扩大趋势和跨境传播风险，已波及全球70多个国家和地区，预计每年感染人数超过200万。截止2016年10月我国已报道20余例输入性病例。鉴于寨卡病毒与小头畸形、格林-巴利综合症等严重神经系统疾病密切关联，此次寨卡疫情被世界卫生组织宣布为“国际关注的突发公共卫生事件”。
　　由于此次寨卡病毒病暴发的广泛性、复杂性和严重性，对病毒的基本生物学特征和致病机制所致甚少，而病毒毒力、传播性和致病性均不明确，疫苗、抗体和药物缺乏，严重制约了寨卡疫情的科学防控。因此，建立当前流行寨卡病毒感染的动物模型，为阐明寨卡病毒致病机理、加快疫苗和抗病毒药物研发及防控寨卡疫情提供重要支撑是我们亟待解决的问题。
　　小鼠不仅是研究病毒致病机理的重要工具，也是评价药物及疫苗有效性和安全性不可替代的重要手段。小鼠性格温顺易饲养，体积小巧易于操作，繁殖能力强，大多数对病毒易感，已广泛应用于各种病毒致病机理研究以及疫苗和药物评价。
　　本研究首先利用虫媒病毒分离鉴定技术平台分离获得寨卡病毒临床分离株，并对其基因组特征、空斑大小、一步生长特性及乳鼠神经毒力等进行了系统鉴定;在此基础上，分别建立了寨卡病毒感染的免疫健全129小鼠和免疫缺陷型A129小鼠动物模型，动态观察其体重变化、临床症状，以及病毒血症和组织脏器分布等一系列指标，初步明确了我国分离的寨卡病毒毒株在不同小鼠上的生物学特征;最后，利用病人恢复期血清抗体及抗病毒药物NITD008在小鼠体内的保护和治疗效果，验证小鼠动物模型的实用性和有效性。
　　一、寨卡病毒的分离与鉴定
　　为了获得我国输入性寨卡病毒临床分离株，我们将患者的尿液接种乳鼠鼠脑。结果显示，乳鼠鼠脑接种后7天开始出现典型的神经症状，实时定量RT-PCR检测到寨卡病毒在鼠脑内大量扩增;间接免疫荧光结果表明，病人恢复期血清与分离得到的病毒特异性结合。蚀斑显示，新分离病毒可感染BHK-21细胞并形成大小均一、边缘清晰的典型蚀斑。电镜结果显示，寨卡病毒颗粒呈圆形，表面光滑，直径大小约40nm。序列分析结果进一步显示，分离获得的寨卡病毒SZ01株属于亚洲谱系，与法属波利尼西亚分离的H/PF/2013毒株具高度同源性。最后，在1日龄乳鼠上评价了新分离毒株的致病性。结果显示，乳鼠在接种103pFU病毒后第9天出现弓背、四肢麻痹振颤以及嗜睡等症状，并开始死亡;同时，在接种12天后的各种组织脏器中均可检测到较高滴度的病毒核酸。上述结果表明，我们成功分离获得了我国境外输入性寨卡病毒毒株，这为后续动物模型建立和评价提供了可靠的毒种资源。
　　二、寨卡病毒感染小鼠动物模型的建立
　　为了建立寨卡病毒感染小鼠模型，本研究分别以免疫健全的129小鼠及IFN-α/β受体缺陷的A129小鼠为研究对象，并经腹腔途径接种105PFU病毒。结果显示，129小鼠感染寨卡病毒后第1天即出现病毒血症高峰，滴度106 RNA copies/ml，逐渐降低，在第3天完全消失;A129小鼠感染后病毒血症可持续7天左右，第2天达到病毒血症高峰，滴度为5.13×108 RNAcopies/ml。组织脏器实时定量RT-PCR检测结果显示，129小鼠和A129小鼠感染寨卡病毒后在各种脏器中均检测到病毒核酸。上述结果表明，成功建立了寨卡病毒感染的小鼠模型，相关数据为下一步疫苗和抗病毒药物的评价提供有益参考。
　　三、小鼠动物模型在抗寨卡病毒药效学评价中的应用
　　本研究进一步利用寨卡病人恢复期血清抗体及抗病毒药物NITD008验证了所建立模型的实用性和有效性。首先，体外抗病毒活性检测结果显示，病人恢复血清抗体可有效的抑制寨卡病毒的复制，中和效价为1∶161;NITD008可有效抑制病毒感染且呈剂量依赖关系，药物浓度越高，病毒的感染效率越低。然后，体外治疗结果显示，与对照组相比，抗体能完全清除寨卡病毒感染129小鼠的病毒血症，并能清除小鼠脾脏和睾丸中的病毒载量。NITD008治疗组A129小鼠病毒血症明显降低2.6倍，其小鼠存活率达70％，且存活的小鼠无任何疾病症状出现。上述结果表明本研究所建立的小鼠模型可应用于抗寨卡病毒药物和抗体评价，同时，也将为今后寨卡病毒疫苗及抗病毒药物研发提供数据支持。
　　综上所述，本研究成功分离获得了当前流行寨卡病毒毒株，建立了不同的寨卡病毒感染小鼠模型，利用中和性抗体和抗病毒药物鉴定了建立的小鼠模型的实用性和有效性，为今后寨卡病毒毒力、传播性和致病性及其致病机理研究提供了可靠的模型，也为疫苗研发、抗体及药物治疗有效性评估奠定了重要基础。

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摘要

前言

第一部分 寨卡病毒的分离与鉴定

第二部分 寨卡病毒感染小鼠动物模型的建立

第三部分 小鼠动物模型在抗寨卡病毒药效学评价中的应用

结论

参考文献

综述 寨卡病毒动物模型研究进展

致谢

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