IL-17诱导人牙周膜成纤维细胞表达RANKL、OPG的p38MAPK通路研究

摘要

实验目的:
　　通过观察p38MAPK信号通路抑制剂(SB203580)对人牙周膜成纤维细胞(HPDLF)表达RANKL、OPG的影响，探究p38MAPK信号通路是否参与IL-17、HPDLF介导破骨细胞分化的过程。明确IL-17诱导人牙周膜细胞促骨吸收作用的可能信号转导途径，探讨IL-17参与正畸相关炎性牙根吸收的发生机制。
　　实验方法:
　　1.采用组织块培养法，体外培养原代HPDLF，并进行传代纯化。取第4代细胞，采用免疫荧光细胞化学法，对所培养的细胞进行来源鉴定。MTT法分别检测0、2.5、5、10、20、40μ mol/L的p38MAPK抑制剂对HPDLF增殖活性的影响。
　　2.Western blot检测20ng/ml的IL-17刺激HPDLF(0、20、40、60、80min)后，细胞内p38MAPK磷酸化蛋白的表达情况。
　　3.实验分为六组:A组（空白对照）、B组(DMSO)、C组（抑制剂）、D组（IL-17）、E组（IL-17+DMSO）、F组（IL-17+抑制剂）。按照分组，用10μmol/L的SB203580，20ng/ml的IL-17处理细胞。RT-PCR检测 HPDLF中RANKL、OPG因子的mRNA表达水平;Western blot、ELISA检测HPDLF中RANKL、OPG因子的蛋白表达水平。
　　实验结果:
　　1.培养的细胞为长梭形，呈放射状生长;传代后细胞均匀分布，生长状态稳定。经鉴定该细胞为来源于间充质细胞，且非上皮来源的细胞。结合取材部位可判定细胞为HPDLF。MTT结果显示，以浓度为0-40μ mol/L的SB203580分别刺激HPDLF，0-10μ mol/L中，OD值随着浓度的增加持续升高，HPDLF增殖活性逐渐增强。在10μ mol/L中，OD值最大，HPDLF增殖活性达到最强。10-40μ mol/L中，OD值随着浓度的增加逐渐下降，HPDLF增殖活性逐渐降低。
　　2.在20ng/ml的IL-17刺激下，磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)的相对表达量随着时间的增加而增大。在60min时达最高水平，80min时开始下降。
　　3.与空白对照组比较，IL-17刺激后RANKL的mRNA、蛋白表达量升高;OPG的mRNA表达量降低;RANKL/OPG的mRNA比值升高。加入抑制剂后，IL-17刺激RANKL的mRNA、蛋白表达量降低;OPG的mRNA表达量升高，RANKL/OPG的mRNA比值降低。IL-17调控RANKL、OPGmRNA表达的作用，被p38MAPK抑制剂阻断。
　　实验结论:
　　1.组织块培养法成功地建立了人牙周膜成纤维细胞系。经传代，细胞纯化，细胞生物学性状稳定。适宜浓度的SB203580对HPDLF增殖活性有促进作用，但过大浓度的SB203580抑制HPDLF增殖，其中10μ mol/L为HPDLF的最适浓度。
　　2.IL-17能激活p38MAPK蛋白，且存在时间依赖性。IL-17通过p38MAPK通路促进HPDLF中RANKL的表达，抑制OPGmRNA表达;上调RANKL/OPG的mRNA比值。

目录

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个人简历

缩略词表

摘要

前言

实验一 人牙周膜成纤维细胞的培养鉴定与p38抑制剂对细胞增殖活性的影响

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

实验二 IL-17对HPDLF的p38MAPK蛋白磷酸化的作用

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

实验三 p38MAPK抑制剂对IL-17诱导人牙周膜成纤维细胞表达RANKL、OPG的影响

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

全文总结

参考文献

附图

综述 IL-17与MAPK信号通路的研究进展

致谢

攻读学位期间发表的学术论文