体外共培养模型中巨噬细胞对HAP诱导HK-2细胞炎性相关因子表达的调控作用研究

摘要

目的:本研究通过构建一个体外共培养模型，将肾小管上皮细胞与不同浓度羟基磷灰石和/或巨噬细胞模拟肾结石形成过程中肾间质的环境，来探究巨噬细胞对羟基磷灰石(Hydroxyapatite，HAP)刺激肾小管上皮细胞炎症因子表达的影响作用。
　　方法:对照组为肾小管上皮细胞（HK-2）细胞（H组），实验组包括:HK-2细胞与巨噬细胞共培养（H+M组），HK-2细胞与HAP共培养（H+A组），巨噬细胞和HAP的共培养组（M+A组），HK-2细胞与巨噬细胞、HAP共培养（H+M+A组）。在H+A组和H+M+A组中，HAP分别以5 ug/cm2(A1)，10 ug/cm2(A2)的浓度进行干预。共培养2、4、6小时后，应用ELISA法检测细胞上清液中趋化因子2（C-C motif chemokine ligand2，CCL-2）的含量。通过检测乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase，LDH)和活性氧簇(Reactiveoxygen species，ROS)水平以了解HK-2细胞损伤的情况。应用DAPI染色、流式细胞术和Bax/Bcl-2比值来检测HK-2细胞凋亡情况。通过WesternBlotting技术检测HK-2细胞骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、胎球蛋白A(Fetuin-A)、Bax、Bcl-2、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein，MAPK)通路蛋白的表达。
　　结果:H+A1、H+A2组中细胞上清液CCL-2的含量高于对照组（P＜0.05），M+A1、M+A2组的CCL-2含量分别高于H+A1、H+A2组（P＜0.05)，H+M+A1、H+M+A2组的CCL-2含量又分别高于H+A1、H+A2组（P＜0.05）。与对照组相比，实验各组中的肾小管上皮细胞OPN表达量升高，具有时间和HAP浓度依赖性;ROS和LDH的水平，Bax/Bcl-2比值也随着HAP的浓度和时间的增加而增加。实验组中HK-2细胞Fetuin-A的表达与对照组相比具有不同程度的下降，尤其以H+M+A1组在第6小时下降最为明显。同时，实验组中HK-2细胞的MAPK通路也不同程度地被激活，其中，H+M+A1组经过MAPK抑制剂处理6小时后，HK-2细胞的胎球蛋白A表达量不受影响。
　　结论:1.HAP可诱导HK-2细胞出现氧化应激和炎性损伤及凋亡，当加入巨噬细胞共培养后，巨噬细胞可以加剧HK-2细胞的损伤和凋亡。2.当HK-2细胞受到HAP的刺激后，细胞OPN蛋白的表达量增加，而且呈时间依赖性和HAP浓度依赖性，同时巨噬细胞可以加剧HK-2细胞OPN的上升。3.在HAP与HK-2细胞共培养体系中，HK-2细胞中胎球蛋白A的低水平表达可能与HAP诱导肾小管上皮细胞过度氧化应激，炎性损伤和细胞凋亡过程中消耗大量胎球蛋白A有关。当加入巨噬细胞共培养后，HK-2细胞中胎球蛋白的下降更明显，提示巨噬细胞对HK-2细胞胎球蛋白A的表达具有一定的调控作用。4.HK-2细胞与巨噬细胞、HAP共培养体系中，HK-2细胞中胎球蛋白A的表达可能不受MAPK通路调控。

目录

声明

摘要

前言

实验对象和材料

实验方法

1、ELISA检测细胞培养液中的CCL-2含量

2、各组细胞的OPN的相对表达量

3、各组细胞的ROS表达

4、各组HK-2细胞上清液LDH的活性

5、各组HK-2细胞的Bax/Bcl-2比值

6、流式细胞术结果

7、DAPI染色结果

8、各组细胞的Fetuin-A的相对表达量

9、各组细胞的P38的相对表达量

10、各组细胞的JNK的相对表达量

11、各组细胞的ERK的相对表达量

12、抑制MAPK通路后H+M+A1组(6H)细胞的Fetuin-A的相对表达量

讨论

全文小结

参考文献

综述

附录

致谢