广西壮药黄根抗乙肝病毒活性成分筛选及作用机制研究

摘要

目的:以HepG2.2.15细胞株为研究模型，茜草科植物黄根(Prismatomeris connata)根部具有抗乙型肝炎活性为基础，对其进行分离纯化，探讨黄根的化学成分抗乙型肝炎病毒的作用机制。
　　方法:1.将95％乙醇浸泡的黄根通过超声提取法，得到乙醇提取浸膏，加入适量蒸馏水分散，分别用石油醚、乙酸乙酯进行萃取分离:石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、水提取物;2.通过MTT法测定黄根不同极性部位对HepG2.2.15细胞增殖能力的影响，酶联免疫吸附法(ELISA法)检测提取物对人肝癌细胞分泌HBeAg和HBsAg的影响，初步筛选出活性部位;3.利用硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析和重结晶等方法对活性部位进行分离纯化获得单体化合物，并通过FT-IR、HPLC、1HNMR、13C NMR等波谱确定化合物的结构和理化性质;4.通过MTT法和ELISA法对分离出的化合物筛选，确定活性最好的单体化合物作为后续受试物;5.以HepG2.2.15细胞株作为模型，采用不同浓度的受试物，拉米夫定为阳性对照，利用实时荧光定量PCR(qPCR)法，流式细胞术，Western Blot法，激光共聚焦显微镜等方法研究其抗乙肝病毒作用机制。
　　结果:1.从黄根中主要分离出9个化合物，大多数属于蒽醌类化合物，其中已证实4个化学结构的化合物，它们分别是:1，3-二羟基-2-甲氧基-9，10-蒽醌(A)，1，3-二羟基-2-羟甲基-9，10-蒽醌(D)，1，3-二羟基-2-甲基-9，10-蒽醌（甲基异茜草素）(F)，蒽醌胆汁酸类偶合物(H)，其中化合物H是首次从天然植物中发现，化合物D是首次从黄根中分离得到;2.化合物A、D、F、H对细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为12.41、8.03、17.05、8.13μg/mL，药物浓度为8μg/mL时，对HBeAg的抑制率分别为-20.95％、61.42％、43.79％、69.30％，对细胞分泌HBsAg的抑制率分别为9.42％、6.15％、23.34％、43.38％;化合物F（甲基异茜草素）活性最好。3.共聚焦发现甲基异茜草素能够迅速进入HepG2.2.15细胞，主要分布在细胞膜、细胞质等细胞器上，下调细胞内游离钙离子浓度，WB和qPCR等实验证实可降低细胞HBV DNA含量和HBeAg水平，下调HBx蛋白的表达水平，甲基异茜草素作用后细胞被阻滞在G1期。
　　结论:黄根中主要包含蒽醌类化合物，甲基异茜草素可能通过抑制HepG2.2.15细胞的增殖，降低乙型肝炎病毒e抗原的分泌，抑制HBx蛋白的表达等途径达到抗乙肝病毒的效果，有望成为新型的抗HBV药物。

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主要英汉缩略语名词对照

摘要

前言

第一章 黄根不同极性部位体外抗乙肝病毒活性的研究

1 实验材料、试剂与仪器

1．2 实验试剂

1．3 实验仪器

2 黄根有效部位的提取

2．1 实验方法

2．2 实验结果

3 黄根有效部位抗乙肝病毒活性实验

3．1 主要试剂的配制

3．2 HepG2．2．15细胞的培养与传代

3．3 细胞生长抑制作用检测

3．4 HBeAg、HBsAg抗原抑制实验

3．5 实验结果

3．6 本章小结

第二章 黄根乙酸乙酯提取物化学成分的分离纯化和结构鉴定以及活性筛选

1 实验材料、试剂与仪器

1．3 实验仪器

2 实验方法

2．1 黄根乙酸乙酯提取物分离纯化

2．2 化合物A、D、F、H细胞生长抑制实验

2．3 化合物A、D、F、H对细胞分泌HBeAg、HBsAg抗原抑制实验

3 实验结果

3．1 化合物理化性质及结构鉴定

3．2 化合物A、D、F、H对HepG2．2．15细胞生长抑制作用

3．3 化合物A、D、F、H对细胞HBeAg和HBsAg分泌的影响

4 本章小结

第三章 甲基异茜草素抗乙肝病毒活性机制的研究

1 实验材料、试剂与仪器

1．1 实验材料

1．2 实验试剂

1．3 实验仪器

2 实验方法

2．1 Western Blot检测甲基异茜草素对HBx蛋白的影响

2．2 实时荧光定量PCR(qPCR)检测甲基异茜草素对HBV-DNA的影响

2．3 流式细胞术检测甲基异茜草素对周期的影响

2．4 甲基异茜草素在HepG2．2．15细胞中的分布实验

2．5 甲基异茜草素对细胞内游离Ca2+浓度的影响

3 统计学分析

4 实验结果

4．1 qPCR法检测甲基异茜草素对HBV DNA拷贝数的影响

4．2 Western blot法检测甲基异茜草素对HBx蛋白表达的影响

4．3 甲基异茜草素对HepG2．2．15细胞周期的影响

4．4 甲基异茜草素在细胞中分布情况

4．5 甲基异茜草素对细胞内游离Ca2+浓度的影响

全文讨论

参考文献

附录

文献综述 乙型肝炎的治疗以及广西壮药黄根的研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文