裂果薯甾体皂苷的分离纯化与其对人肝癌细胞的凋亡作用及机制研究

摘要

目的:
　　1.分离纯化裂果薯皂苷，建立裂果薯甾体皂苷化合物的分离制备方法，并考察其对人肝癌细胞的抑制作用，确证裂果薯抗肝癌的具体成分。2.裂果薯甾体皂苷化合物Ⅰ(SPHSⅠ)和甾体皂苷化合物Ⅱ(SPHSⅡ)诱导人肝癌HepG2和SMMC-7721细胞凋亡的作用并探讨其作用机制。
　　方法:
　　1.80％乙醇常压提取裂果薯块茎，石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取醇提物，正丁醇萃取部位经D101大孔吸附树脂富集皂苷，50％-95％的乙醇梯度洗脱;硅胶柱和Sephadex LH-20柱对75％乙醇组分进行分离纯化，得到裂果薯甾体皂苷化合物，采用NMR技术进行结构鉴定。同时采用MTT法观察各组分对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用。2.MTT法和集落形成法观察SPHSⅠ和SPHSH对HepG2和SMMC-7721细胞的增殖抑制作用。Hoechst33258法观察SPHSⅠ和SPHSⅡ对HepG2和SMMC-7721细胞凋亡形态的影响。透射电镜观察SPHSⅠ和SPHSⅡ对HepG2和SMMC-7721细胞的细胞超微结构形态特征。3.采用流式细胞仪检测SPHSⅠ和SPHSⅡ对HepG2和SMMC-7721细胞细胞凋亡、细胞周期、细胞内活性氧(ROS)水平和线粒体膜电位(MMP)的影响，N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理后再次测定上述指标。Western blot(WB)法检测SPHSⅠ和SPHSⅡ对HepG2和SMMC-7721细胞凋亡相关蛋白和MAPK信号通路蛋白表达的影响。
　　结果:
　　1.裂果薯醇提物、正丁醇部位、75％乙醇和95％乙醇组分能抑制SMMC-7721细胞的增殖，IC50分别为92.35、56.26、5.69、5.49μg/mL。75％乙醇组分经反复分离纯化，得到裂果薯皂苷Ⅰ123.4mg、裂果薯皂苷Ⅱ203.8mg和豆甾醇苷546.8mg;经1H NMR、13C NMR分析，其结构分别被确定为:(25S)-spirost-5-en-3β-yl-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranoside、Yamogenin3-0-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranoside和stigmasterol3-O-β-D-gIucopyranoside。
　　2.SPHSⅠ显著抑制HepG2和SMMC-7721细胞的增殖，其24h的IC50为0.91和1.00μM;SPHSⅡ显著抑制HepG2和SMMC-7721细胞的增殖，其24h的IC50为0.57和0.56μM。集落形成实验结果显示，SPHSⅠ和SPHSⅡ显著抑制HepG2和SMMC-7721细胞的增殖，呈浓度依赖性(P＜0.001)。Hoechst33258染色结果显示，空白对照组细胞核形态清晰完整，呈淡蓝色荧光;给药组可观察到明显的细胞形态学变化，如形成凋亡小体等凋亡特征。透射电镜结果显示，空白对照组细胞膜和细胞器结构完整;而给药组细胞缩小，染色质凝聚加深边集于细胞膜及染色体固缩，产生大量的的凋亡小体等凋亡特征。流式凋亡实验结果显示，SPHSⅠ和SPHSⅡ显著诱导HepG2和SMMC-7721细胞凋亡，提高细胞总凋亡率并呈浓度依赖性(P＜0.001)。流式周期实验结果显示，SPHSⅠ和SPHSⅡ阻滞HepG2和SMMC-7721细胞于G2期，呈浓度依赖性(P＜0.001)。流式凋亡实验结果显示，NAC能部分阻断SPHSⅠ和SPHSⅡ对HepG2和SMMC-7721细胞的凋亡诱导作用，NAC+SPHSⅠ(或SPHSⅡ)组与SPHSⅠ(或SPHSⅡ)组比较有统计学差异(P＜0.001)。流式周期实验结果显示，NAC能部分阻断SPHSⅠ和SPHSⅡ对HepG2和SMMC-7721细胞的周期阻滞作用，NAC+SPHSⅠ(或SPHSⅡ)组与SPHSⅠ(或SPHSⅡ)组比较有统计学差异(P＜0.001)。
　　3.流式活性氧实验结果显示，SPHSⅠ和SPHSⅡ能提高HepG2和SMMC-7721细胞的ROS，且呈浓度依赖性(P＜0.001)。流式线粒体膜电位实验结果显示，SPHSⅠ和SPHSⅡ能降低HepG2和SMMC-7721细胞的MMP，且呈浓度依赖性(P＜0.001)。流式活性氧实验结果显示，NAC能部分阻断SPHSⅠ对HepG2和SMMC-7721细胞ROS的提高，NAC+SPHSⅠ组与SPHSⅠ组比较有统计学差异(P＜0.001)。流式线粒体膜电位实验结果显示，NAC能部分阻断SPHSⅠ和SPHSⅡ对HepG2和SMMC-7721细胞MMP的降低，NAC+SPHSⅠ(或SPHSⅡ)组与SPHSⅠ(或SPHSⅡ)组比较有统计学差异（P＜0.01或P＜0.05）。WB实验结果显示，SPHSⅠ和SPHSⅡ作用HepG2和SMMC-7721细胞后能上调cleaved caspase-3、-8、-9、Cyto-C和Bax蛋白的表达，下调Bcl-2和PARP蛋白的表达;对MAPK相关蛋白的表达没有影响，但是能显著提高Erk、P38和JNK的磷酸化水平。
　　结论:
　　1.从裂果薯分离得到裂果薯甾体皂苷化合物Ⅰ、裂果薯甾体皂苷化合物Ⅱ和豆甾醇苷化合物，初步建立裂果薯甾体皂苷化合物Ⅰ和裂果薯甾体皂苷化合物Ⅱ的分离制备方法。2.SPHSⅠ和SPHSⅡ对人肝癌HepG2和SMMC-7721细胞均具有增殖抑制和诱导凋亡的作用，其作用机制可能是通过ROS介导的线粒体途径，并调控MAPK信号通路实现的。

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