广西眼镜蛇毒细胞毒素-4N的分离纯化及其对HSC-T6细胞ERK信号通路的影响

摘要

目的:为了获得高纯度的眼镜蛇毒细胞毒素-4N(CTX-4N)，探索眼镜蛇毒中细胞毒素-4N对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)的增殖抑制作用和CTX-4N通过ERK信号通路对HSC-T6细胞凋亡的影响，从而阐明CTX-4N通过ERK信号通路诱导肝星状细胞凋亡的机制。
　　方法:采用DEAE-Sepha roseCL-6B阴离子交换柱、SpehadexG-50凝胶层析柱、Macro-prep High S阳离子交换柱结合的方法对眼镜蛇毒蛋白进行分离纯化。采用HSC-T6增殖抑制实验对每一步分离后的各峰蛋白CTX-4N进行活性检测。收集活性最强的蛋白峰，在用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定其纯度。采用蛋白质谱法鉴定其成分及分子量大小。用CCK-8方法检测不同浓度的CTX-4N对HSC-T6的增殖抑制作用。采用流式细胞术检测CTX-4N对HSC-T6细胞凋亡的影响。采用Western-Blot检测CTX4-N作用HSC-T6细胞不同时间后，ERK信号通路中ERK1/2的磷酸化水平的变化;以及在加入抑制剂PD98059处理HSC-T6细胞后，ERK信号通路中ERK1/2磷酸化水平的变化。抑制剂实验分组:空白对照组、CTX-4N组、抑制剂组和CTX-4N+抑制剂组。
　　结果:通过DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换柱、SpehadexG-50凝胶层析柱、Macro-prep HighS阳离子交换柱分离纯化后得到一个电泳纯度的蛋白，蛋白质谱鉴定为CTX-4N，分子量约为9.605 KDa。不同浓度的CTX-4N对HSC-T6细胞具有增殖抑制作用，随着浓度的增加而增强，最小抑制浓度为2μg/mL，呈剂量-效应关系，IC50为(12.836±0.045)μg/mL。不同浓度的CTX-4N对HSC-T6细胞的凋亡作用随着浓度的增加而增强，且诱导HSC-T6凋亡的最小浓度为4μg/mL。以4μg/mL的CTX-4N作用HSC-T6不同时间后，各时间点的ERK1/2蛋白表达没有变化，而磷酸化ERK1/2蛋白的表达一开始是随着作用时间的延长而表达增加，作用10min后磷酸化ERK1/2表达水平最高，随后就开始降低，到60min后其表达低于对照组。以10μ mol/L的PD98059和4μg/mL的CTX-4N作用HSC-T6细胞后，ERK1/2蛋白的表达没有发生改变，而可以显著的抑制磷酸化ERK1/2的表达。
　　结论:广西眼镜蛇毒通过DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换柱、SpehadexG-50凝胶层析柱、Macro-prep High S阳离子交换柱分离纯化获得电泳纯度的CTX-4N。CTX-4N能使HSC-T6细胞发生凋亡作用，对ERK信号通路中的磷酸化ERK1/2表达具有抑制作用，因此，CTX-4N可能通过ERK信号通路诱导HSC-T6凋亡，来干预肝纤维化的发生和发展。

目录

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个人简历

摘要

前言

第一部分 广西眼镜蛇毒细胞毒素-4N分离纯化的研究

1 材料和方法

2 实验结果

3 讨论

4 小结

第二部分 广西眼镜蛇毒CTX-4N对HSC-T6细胞ERK信号通路磷酸化蛋白表达的影响

1 材料和方法

2 实验结果

3 讨论

4 小结

结论

参考文献

附录

综述 眼镜蛇毒液中主要活性成分研究进

致谢

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