广西眼镜蛇毒神经生长因子的精制及其对HSC-T6细胞ERK1/2、p38信号通路的影响

摘要

目的：①对广西眼镜蛇蛇毒神经生长因子(nerve growth factor，NGF)的分离纯化方法进行改良，以获得高活性、电泳纯的的神经生长因子。②探索广西眼镜蛇毒神经生长因子对肝星状细胞株(Hepatic stellate cells-T6，HSC-T6)ERK1/2、p38信号通路中磷酸化蛋白表达的影响，为阐明肝纤维化的发生发展的机制提供理论依据。
　　方法：①在Sephadex G-50凝胶层析柱、CM-Sepharose CL-6B弱阳离子交换柱分离广西眼镜蛇毒粗毒的基础上，利用DUOFLOW系统和Macro-prep High S预装柱进一步分离精制神经生长因子。利用SDS-PAGE凝胶电泳进行纯度和分子量测定;②利用大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12)细胞对神经生长因子进行活性测定，测定使PC12细胞发生突触样变化的最小浓度，然后计算神经生长因子纯化的得率;③CCK-8法测定神经生长因子对肝星状细胞(HSC-T6)的增殖抑制作用，找出引起其凋亡的最小毒性浓度;④利用western blotting检测神经生长因子作用肝星状细胞后，细胞ERK1/2、p38信号通路磷酸化蛋白的表达随作用时间(0、5、10、30、60、120min)的变化情况;⑤分为空白组（无抑制剂、无NGF）、抑制剂组（只加入抑制剂）、抑制剂+NGF组、NGF组（只加入NGF）四组，抑制剂组与抑制剂+NGF组均用抑制剂PD98059预处理1h后，抑制剂+NGF组与NGF组采用NGF干预1h，WB检测各组ERK1/2信号通路磷酸化蛋白的表达情况
　　结果：①Sephadex G-50凝胶层析柱、CM-Sepharose CL-6B离子交换柱分离纯化后得到的第Ⅲ峰组分经Macro-prep High S预装柱分离所得的第Ⅰ峰组分为电泳纯，具有神经生长因子活性，作用PC12细胞72h后使其发生突触样变化的最小浓度为100ng/ml;计算得率为1.21％，分子量为23.54KDa;②神经生长因子在0～1μg/ml的浓度下对HSC-T6细胞具有一定的促增殖作用，2μg/ml时细胞数达到最大值，4～16μg/ml时对细胞生长有抑制作用，且随浓度增大细胞数减小;③以最小毒性浓度（2μg/ml）神经生长因子作用于HSC-T6细胞，不同时间(0、5、10、30、60、120min)后，ERK1/2和p38两个信号通路的磷酸化蛋白的表达量均随作用时间的延长而逐渐减弱;10μM PD98059抑制剂+2μg/ml NGF组较显著的抑制ERK1/2磷酸化蛋白的表达，其他组对其的影响不具统计学意义。
　　结论：①采用DUOFLOW系统利用Macro-prep High S预装柱进一步分离得到电泳纯高活性的NGF组分;②神经生长因子对ERK1/2、p38信号通路磷酸化蛋白的表达存在抑制作用，可能抑制ERK1/2、p38通路，进而影响肝纤维化的发生与发展。

目录

声明

个人简历

主要缩略词

摘要

前言

第一部分 运用BIO-RAD DUOFLOW系统Macro-prep High S预装柱精制广西眼镜蛇毒神经生长因子

1．材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 实验结果

1．4 讨论

1．5 小结

第二部分 蛇毒神经生长因子对HSC-T6信号通路磷酸化蛋白的表达的影响

1．材料与方法

1．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

2．5 小结

参考文献

附录

综述 蛋白质的分离纯化策略

致谢

在读期间研究情况