HIV-1外周血PBMC病毒储存库PCR检测方法及临床意义的探讨

摘要

目的:对目前报道的检测HIV病毒库的两种方法(alu-PCR检测整合型HIV-1DNA和荧光探针PCR检测HIV-1total DNA)的可靠性、特异性进行评估，选出更加适用于临床检测病毒库的方法。并用横断面样本验证所选方法的可靠性及实用性。
　　方法:(1)使用QIAamp DNA Mini kit试剂盒提取HIV-1感染者的外周血单个核细胞的总DNA;(2)应用2套引物方案验证Alu-PCR检测整合型HIV-1DNA的特异性;(3)验证荧光探针PCR法检测HIV-1total DNA的灵敏度、特异度，并用横断面（HIV-1RNA转阴1～6年以上）的HIV-1感染者的样本，进一步评估荧光探针PCR检测HIV-1total DNA的可靠性及实用性。
　　结果:(1)alu-PCR检测整合型HIV-1DNA:20例HIV-1感染者PBMC内的DNA样本，在方案1和方案2第一轮PCR产物的电泳图中均无条带，且扩增产物浓度低，无法完成基因测序。第二轮PCR扩增产物电泳图中，方案1有9例(n=20)样本在240bp处有亮带，其扩增产物基因测序后进行序列比对，其中4例符合整合型HIV-1DNA片段，5例仅有人的基因组片段，即方案1的第二轮扩增产物中整合HIV DNA片段的阳性检出率为20％(4/20);方案2有12例(n=20)样本在350bp处有亮带，其扩增产物测序后进行序列比对，均有HIV-1DNA片段而未含有人的基因组片段，即方案2的第二轮扩增产物中HIV DNA片段的阳性检出率为60％(12/20)。
　　(2)本研究的荧光定量PCR检测HIV total DNA实验方法检测的线性范围为50-104拷贝/106cells;该方法用于检测20例HIV-1感染者PBMC样本，其扩增产物经基因测序后序列比对90％均符合HIV-1DNA片段，20例样本的HIV DNA阳性检出率为100％;8例健康对照的HIV-1total DNA的阳性检出率为0，特异性100％。用该方法检测47例横断面的临床样本，未治疗的HIV-1感染者以及HIV-1RNA阴转后1-2年、3-4年、5-6年的HIV-1感染者PBMC内的HIV-1total DNA均数分别为（3.24±0.58）、（2.93±0.69）、（2.84±0.55）、（2.53±0.48）log10copies/106PBMC），总体趋势是HIV-1RNA阴转时间越长，其HIV-1total DNA越低。
　　结论:(1)Alu-PCR检测整合型HIV-1DNA特异性有待进一步验证。(2)荧光探针PCR检测HIV total DNA的方法，敏感性高，特异性好，可行性及实用性强，有望成为临床观察HAATR治疗后，HIV存储库消耗的血清学标记物。

目录

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个人简历

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摘要

前言

材料和方法

2．1 研究对象的选择

2．2 标本的收集及处理

2．3 主要实验仪器、试剂

2．4 实验技术路线图

2．5 实验方法

结果

3．1 Alu-PCR整合型HIV DNA

3．2 荧光探针PCR检测HIV-1 total DNA

讨论

1．目前检测HIV-1病毒库的方法

2．Alu-PCR检测整合型HIV-1 DNA特异性

3．HI-1 total DNA检测

结论

研究创新点

参考文献

综述 HIV-1病毒储存库及检测方法的进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文