山莨菪碱对5-氟尿嘧啶致血管内皮细胞损伤的保护机制研究

摘要

近年来，癌症的发病率和致死率逐年增高，是严重危害人类生命健康的主要疾病之一。5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-Fu)为目前使用较为广泛的抗代谢类抗肿瘤药物，在肿瘤治疗中占据了重要的地位。国内外研究表明，5-Fu可通过肿瘤坏死因子诱导配体介导的凋亡通路或改变凋亡相关基因的表达及细胞动力学来诱导肿瘤细胞凋亡。由于其组织选择性差，在抑制肿瘤细胞生长的过程中，也抑制了正常组织细胞的正常生理活动，特别是可引起血管内皮细胞的功能与结构的紊乱，使血管内皮细胞发生炎症反应或处于氧化应激状态，进而启动其内在的凋亡程序，最终导致血管内皮损伤，给患者带来严重的并发症并影响其生存质量。
　　山莨菪碱(anisodamine，Ani)是从茄科植物唐古物莨菪中分离出的一种生物碱，其在药理学上属于M胆碱受体阻滞剂，具有改善微循环、解除血管痉挛、镇痛及抑制腺体分泌的作用。临床上主要用于治疗中毒性休克、平滑肌痉挛、血管性疾病、眼底疾病和各种神经痛等。随着人们对Ani作用机制的深入研究发现，Ani除了具有M胆碱受体阻断作用外，还有具有其他作用，包括:抗氧化作用、钙拮抗作用、降低一氧化氮水平、增加细胞膜流动性等。
　　本课题将从氧化应激和细胞凋亡两个方面探讨5-Fu对血管内皮细胞的损伤机制，并研究Ani对5-Fu致血管内皮细胞损伤的保护作用，为从细胞水平逐步深入到分子生物学的基因、蛋白表达的研究提供实验资料和理论依据。
　　第一部分 5-氟尿嘧啶诱导血管内皮细胞损伤模型的建立
　　目的:建立5-Fu诱导血管内皮细胞损伤模型，为下一步探讨5-Fu损伤血管内皮的机制及血管内皮损伤的防治策略提供实验基础。
　　方法:体外进行人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelialcells，HUVECs)培养，用不同浓度5-Fu(5、10、20、40、50mmol/L)分别作用细胞12、24、48h，采用噻唑兰(Thiazolyl blue tetrazolium brom-id，MTT)法检测细胞活力。
　　结果:HUVECs与不同浓度5-Fu(5、10、20、40、50mmol/L)共同孵育不同时间(12、24、48h)后，其细胞增殖抑制率与对照组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）。根据计算得出12h、24h和48h的半数抑制浓度(Half inhibitory concentration，IC50)分另为45.5mmol/L、6.9mmol/L和0.083mmol/L。
　　结论:10mmol/L5-Fu作用HUVECs24h时为最佳损伤浓度，为理想的造模条件。
　　第二部分 山莨菪碱对5-氟尿嘧啶致血管内皮细胞损伤的保护作用
　　实验一 山莨菪碱对5-氟尿嘧啶诱导的血管内皮细胞增殖的影响
　　目的:探讨Ani对5-Fu诱导的血管内皮细胞增殖的影响。
　　方法:1.通过体外培养HUVECs，用不同浓度Ani(6.25、12.5、25、50、100mg/L)处理细胞4h后，采用MTT法检测细胞活力;2.通过体外培养HUVECs，用不同浓度Ani(6.25、12.5、25、50、100mg/L)作用细胞4h后，加入10mmol/L5-Fu作用24h，采用MTT法检测细胞活力。
　　结果:1.HUVECs与不同浓度Ani(6.25、12.5、25、50、100mg/L)共同孵育4h后，其细胞增殖抑制率与对照组相比，差异均无统计学意义(P＞0.05);2.不同浓度Ani(6.25、12.5、25、50、100mg/L)作用细胞2h、4h后，加入10mmol/L5-Fu作用24h，结果显示，与对照组相比，模型组细胞增殖抑制率显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05）;各浓度组细胞增殖抑制率与模型组相比，差异均有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论:在一定浓度范围内Ani对HUVECs无损伤作，且Ani具有抑制5-Fu诱导HUVECs存活率下降的作用。当Ani浓度为25mg/L，作用时间为4h时，对细胞的保护效果最佳。
　　实验二 山莨菪碱对5-氟尿嘧啶致血管内皮细胞氧化损伤的保护作用
　　目的:探讨Ani对5-Fu致血管内皮细胞氧化损伤的保护作用。
　　方法:随机将HUVECs分为四组:空白对照组、Ani组、5-Fu组、Ani+5-Fu组。采用流式细胞术和测定试剂盒分别检测细胞内活性氧(Reactive oxygenspecies，ROS)含量及超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)和过氧化氢酶(Catalase，CAT)活性。
　　结果:与对照组相比，5-Fu组中ROS含量明显增多，SOD、CAT的活性显著降低，差异有统计学意义（P＜.05）;与5-Fu组相比，Ani+5-Fu组中ROS含量明显降低，SOD、CAT活性显著升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论:Ani可对5-Fu致血管内皮细胞氧化损伤起到保护作用。
　　实验三 山莨菪碱对5-氟尿嘧啶致血管内皮细胞凋亡的保护作用
　　目的:探讨Ani对5-Fu致血管内皮细胞凋亡的保护作用。
　　方法:随机将HUVECs分为四组:空白对照组、Ani组、5-Fu组、Ani+5-Fu组。采用流式细胞术(Annexin V-FITC/PI双染法)检测细胞凋亡。
　　结果:结果发现，与对照组相比，5-Fu组可见大量早期凋亡细胞，差异有统计学意义（P＜0.05）;Ani+5-Fu组的细胞凋亡率较5-Fu组显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　结论:Ani可明显抑制5-Fu对HUVECs的损伤，降低HUVECs的凋亡率，对血管内皮细胞起到保护作用。

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摘要

前言

第一部分 5-氟尿嘧啶诱导血管内皮细胞损伤模型的建立

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第二部分 山茛菪碱对5-氟尿嘧啶致血管内皮细胞损伤的保护作用

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

实验二 山莨菪碱对5-氟尿嘧啶致血管内皮细胞氧化损伤的保护作用

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

实验三 山莨菪碱对5-氟尿嘧啶致血管内皮细胞凋亡的保护作用

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

结论

参考文献

综述 血管内皮细胞损伤机制的研究

致谢

攻读学位期间发表的学术论文