低剂量TGF-β1维持三维培养模型中牛角膜基质细胞生长和缓解ECM纤维化的作用

摘要

背景:转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）在角膜损伤修复过程中发挥重要作用，其浓度变化对角膜细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的合成具有不同影响。既往研究多集中于高浓度(2ng/ml-10ng/ml) TGF-β1对二维培养的角膜基质细胞的影响，我们前期的研究不仅成功建立了牛角膜基质细胞体外三维培养模型，并且用0.5ng/ml-1ng/ml的TGF-β1刺激牛角膜基质细胞，观察到了其对ECM合成的影响。而低浓度TGF-β1对角膜基质细胞体外三维培养模型中ECM合成的影响还有待研究。
　　目的:以牛角膜基质细胞体外三维培养模型为基础，研究低浓度TGF-β1对体外三维培养模型中的角膜基质细胞生长状况及ECM合成的影响。
　　方法:利用Pellet体外三维培养模型培养原代牛角膜基质细胞，实验分为0.25ng/ml TGF-β1+5％ FBS组和0.50ng/ml TGF-β1+5％ FBS组，在一定时间点对培养物进行检测。应用钙黄绿素-AM/碘化丙啶法（Calcein-AM/PI法）测定角膜基质细胞的活性;行HE染色观察细胞结构;应用实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、纤维链接蛋白(Fibronectin，FN)、Ⅰ型胶原蛋白(typeⅠ collagen，ColⅠ)、Ⅲ型胶原蛋白(typeⅢ collagen，ColⅢ)在mRNA水平的表达，并检测角膜蛋白(Keratocan，KERA)与基膜聚糖(Lumican，LUM)两基因在Pellet培养不同时间时的表达情况;应用免疫荧光细胞化学法及蛋白质印迹法(Western Blot)检测蛋白水平上α-SMA、FN、ColⅠ、ColⅢ的表达情况。
　　结果:Pellet细胞在48h、1周、2周、3周时均成团生长，细胞死亡率随培养时间延长而逐渐增长，两组间细胞死亡率无明显差异(P=0.887)。HE染色显示Pellet球内均有大量红染的胶原纤维，大部分结构完整的细胞。0.25ng/ml TGF-β1+5％ FBS组ColⅢ/ColⅠ比值分别在转录水平和蛋白表达水平均低于0.50ng/ml TGF-β1+5％ FBS组（PmRNA=0.038，Pprotein=0.032）。KERA与LUM基因在48h、1周、2周时均有表达。LUM基因表达在0.25ng/mlTGF-β1+5％ FBS组随培养时间延长而逐渐增加(P=0.006);而在0.50ng/mlTGF-β1+5％ FBS组中，LUM基因表达在1周时达到峰值，2周时下降(P＜0.001)。KERA基因表达在两个实验组中均在培养1周时达到峰值，2周时表达下降(P0.25ng/ml TGF-β1组=0.004; P0.50ng/ml TGF-β1=0.020)。0.25ng/mlTGF-β1+5％ FBS组的α-SMA、FN、ColⅢ蛋白表达量均低于0.50ng/mlTGF-β1+5％ FBS组(Pα-sMA=0.010,PFN=0.040,PColⅢ＜0.001)，但0.25ng/mlTGF-β1+5％ FBS组ColⅠ的蛋白表达量却显著高于0.50ng/ml TGF-β1+5％FBS组(PColⅠ=0.016)。
　　结论:在Pellet体外三维培养模型中，经低浓度TGF-β1刺激培养后，角膜基质细胞能维持正常生长，并且能够合成ECM。低浓度TGF-β1刺激合成的ECM成分比例较高浓度的TGF-β1刺激合成的ECM成分比例有所不同，但TGF-β1浓度降低使ECM成分合成偏向于正常状态，有无瘢痕化修复的趋势。

目录

声明

个人简历

摘要

前言

1 牛角膜细胞的取材

2 材料与主要仪器

二、方法

1 牛角膜基质细胞的分离与培养

2 体外三维培养模型的建立

3 实验分组

4 Pellet模型病理学观察

5 细胞活性测定

6 实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)法检测Pellet中α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、纤维连接蛋白(fibronectin，FN)、Ⅰ型胶原(type Ⅰ collagen，Col Ⅰ)、Ⅲ型胶原(type Ⅲ collage，ColⅢ)、基膜聚糖(LUM)、角膜蛋白(KERA)基因的转录水平

7 免疫荧光细胞化学法检测Pellet中α-SMA、FN、ColⅠ、ColⅢ的表达量

8 蛋白质印迹法(Western-Blot)检测Pellet中α-SMA、FN、ColⅠ、ColⅢ的表达量

9 统计学方法

三、结果

1 Pellet模型的生长情况(图1、2、3、4)

2 mRNA表达情况(图5)

3 免疫荧光检测的蛋白表达情况(图6)

4 Western-Blot检测的蛋白表达情况(图7)

5 CoⅢ／ColⅠ比值情况

四、讨论

1 研究角膜基质损伤修复的病理生理过程是探寻减少角膜基质瘢痕化手段的重要基础，具有重要临床意义

2 角膜基质损伤修复的基本病理生理过程

3 体外三维培养研究手段在角膜基础研究中的应用

4 TGF-β在角膜基质损伤修复中的作用

五、结论

参考文献

附录

综述 角膜基质组装及损伤修复研究进展

致谢

攻读学位期间发表的学术论文