基于人EGFR为靶点的萤光素酶报告系统的构建及在蒽醌类抗肿瘤药物筛选中的应用

摘要

目的：
　　1.构建EGFR启动子萤光素酶报告基因A549-EGFR-Luc2和CNE1-EGFR-Luc2稳转细胞模型;
　　2.利用EGFR萤光素酶报告系统在转录水平筛选靶向调控EGFR抗肿瘤的候选化合物;
　　3.探讨靶向调控EGFR与抗肿瘤活性的关系,为抗肿瘤药物设计、合成和开发提供新的策略。
　　方法：
　　1、利用Western blot技术检测鼻咽癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌及人鼻咽正常上皮细胞和乳腺正常细胞的EGFR蛋白表达水平,确定EGFR高表达活性的细胞作为研究对象。
　　2、利用基因重组技术,构建含EGFR启动子的萤光素酶报告基因重组慢病毒表达载体,分别感染具有EGFR高表达活性的A549和CNE1细胞,获得稳定表达萤光素酶的A549-EGFR-Luc2和CNE1-EGFR-Luc2细胞系。
　　3、通过萤光素酶实活性验对萤光素酶报告系统的关键条件进行优化,并检测化疗药物吉非替尼、顺铂、先导化合物大黄酸以及蒽醌化合物4a、B、C、H、I、J、K和N调控A549-EGFR-Luc2和CNE1-EGFR-Luc2细胞EGFR启动子的活性。
　　4、MTT法确定化疗药物吉非替尼、顺铂、先导化合物大黄酸以及蒽醌化合物4a、B、C、H、I、J、K和N对A549和CNE1两株细胞半数抑制浓度IC50,Western blot检测各种化合物对A549和CNE1细胞EGFR蛋白表达活性。
　　5、以A549和CNE1细胞为研究对象,选择吉非替尼、大黄酸、顺铂、蒽醌化合物4a、B、C和H为受试物,联合照射,对各组细胞测定下列各项指标:(1)MTT检测各组细胞的生长抑制率;(2)细胞克隆形成实验检测各种化合物对A549和CNE1细胞放射增敏活性;(3)Western blot检测各组细胞EGFR蛋白表达水平;(4)彗星实验检测各组细胞DNA损伤的情况;
　　6、免疫荧光法观察化疗药物紫杉醇、蒽醌化合物4a和H对A549和CNE1细胞F-actin微丝骨架形成的影响。
　　结果：
　　1.Western blot检测结果显示,A549和CNE1细胞具有较高的EGFR蛋白表达活性;
　　2.根据基因测序和质粒双酶切鉴定结果,含EGFR基因启动子萤光素酶报告基因的慢病毒表达载体成功构建,慢病毒感染A549和CNE1细胞经嘌呤霉素筛选后获得稳定表达萤光素酶的A549-EGFR-Luc2和CNE1-EGFR-Luc2稳转细胞株。萤光素酶报告基因结果显示,A549-EGFR-Luc2和CNE1-EGFR-Luc2细胞的萤光素酶表达活性分别是Negtive control组的49倍和43倍。
　　3.萤光素酶报告基因系统试验条件优化结果表明,当接种细胞数为5000个/孔,反应温度为25℃,细胞裂解时间为5min时,细胞内萤光素酶表达量较高,因此选择该条件作为后续萤光素酶报告系统进行药物筛选的检测条件。萤光素酶报告系统检测发现,吉非替尼、蒽醌化合物4a、B、C、H对A549-EGFR-Luc2和CNE1-EGFR-Luc2细胞EGFR启动子均具有良好的抑制作用;
　　4.MTT实验结果显示,吉非替尼对A549和CNE1两株细胞均有较好的生长抑制活性,蒽醌化合物4a、B、C、H、I、N对CNE1细胞的半数抑制浓度性显著低于A549细胞;化合物H、N对A549和CNE1细胞半数抑制浓度与先导化合物大黄酸相比均显著降低(P＜0.001)。
　　5.Western blot实验结果表明,吉非替尼、化合物4a、B、C以及H可以通过靶向抑制EGFR基因启动子转录活性从而下调A549和CNE1细胞EGFR蛋白表达水平,且抑制活性均优于先导化合物大黄酸。
　　6.各种化合物联合照射处理细胞后,(1)MTT实验结果表明,单独化合物及单独照射处理对细胞的生长抑制率均较小,但两者联合作用后,可显著增加A549和CNE1两株细胞生长抑制率,特别是蒽醌化合物4a、B、C、H联合照射组明显优于单独照射组(P＜0.05);(2)克隆形成实验表明吉非替尼、蒽醌化合物4a、C、H对A549细胞具有良好的放射增敏作用,放射增敏比SER分别为1.462,1.619,1.708和1.290,放射增敏活性优于大黄酸;蒽醌化合物4a、C、顺铂与大黄酸相比对CNE1细胞具有明显的放射增敏活性,放射增敏比分别为1.256、1.184和1.206。(3)Western blot实验结果表明,射线可以激活肿瘤细胞EGFR蛋白表达水平,但照射联合吉非替尼、蒽醌化合物4a、B、C、H均可以显著下调A549和CNE1细胞EGFR表达水平。(4)单独照射对两种肿瘤细胞的DNA损伤效应并不明显,但照射联合吉非替尼、蒽醌化合物4a、C以及H处理细胞后彗星尾部DNA(Tail-DNA)含量明显大于单独用药组和单独照射组(P＜0.005)。
　　7.免疫荧光法检测结果显示,随着蒽醌化合物4a和H作用时间的延长,可明显降低A549细胞和CNE1细胞内F-actin微丝的表达量,细胞微丝骨架发生重排,细胞核周出现标志性的F-actin环,细胞骨架完整性丧失。
　　结论：
　　1.成功构建了基于EGFR启动子的萤光素酶报告系统,获得了在转录水平上筛选靶向抑制EGFR的抗肿瘤药物筛选细胞模型。
　　2.蒽醌化合物4a、B、C以及H对A549和CNE1细胞的生长抑制活性及靶向EGFR抑制活性均优于先导化合物大黄酸。
　　3.无细胞毒浓度的蒽醌化合物4a、C以及H联合射线处理肺癌A549细胞和鼻咽癌CNE1细胞,具有放射增敏作用,其增敏活性优于先导化合物大黄酸。
　　4.蒽醌化合物4a和H可抑制细胞内EGFR表达,减少EGFR下游信号通路的活化,促进细胞内F-actin微丝的解聚和重排从而引起肿瘤细胞微丝骨架破坏,导致肿瘤细胞死亡。

目录

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个人简历

主要英文缩略词表

摘要

前言

第一章 EGFR启动子萤光素酶报告基因稳转细胞系的构建

引言

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

第二章 基于EGFR萤光素酶报告系统在蒽醌类抗肿瘤药物中的筛选

引言

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

第三章 候选化合物抗肿瘤活性研究

引言

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

全文小结

参考文献

综述 靶向药物设计与筛选新进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文