内皮微环境NOTCH信号通路促进人多能干细胞造血分化的实验研究

摘要

造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)是造血组织中的一群具有自我更新能力及分化为所有成熟血细胞类型的多潜能干细胞，也是获得可供临床造血干细胞移植和输血治疗的成熟血细胞的理想种子细胞。但造血干细胞来源紧缺、配型成功率低、移植费用高等问题也成为了临床应用的障碍。人诱导性多能干细胞(human induced pluripotent stem cells，hiPSCs)的出现有望解决这一种子细胞匮乏的难题。但目前hiPSCs体外诱导获得的HSCs虽然具有造血干细胞的表型，但却不具备体内长期重建造血的能力。其主要原因是个体造血发育复杂性尚未阐释清楚、体外建立的造血分化模型不能很好的模拟体内造血发育微环境，且诱导分化体系也需要进一步优化。
　　目前研究表明造血干细胞发育分化的关键步骤是生血内皮造血转化，生血内皮细胞能够向造血细胞和内皮细胞双向分化。在人的造血发育过程中，NOTCH信号通路已被证实对生血内皮细胞向造血细胞分化及增殖等具有关键的调控作用。目前的研究表明，NOTCH信号通路中DLL4配体的表达对于生血内皮造血命运的决定发挥了关键作用，在人多能干细胞的体外分化中，高表达DLL4的生血内皮前体细胞能够促进DLL4低表达或阴性的生血内皮向造血干细胞分化，但是这种情况下获得的造血干细胞却仍然不具有重建长期造血的功能，提示具有长期造血重建能力的造血干细胞生成仍需要其他关键因素的作用。而内皮微环境(vascular niche)所介导的NOTCH信号通路的激活以及下游造血相关转录因子runx1及gata-2的表达，对于造血干细胞的生成也是至关重要的。
　　基于上述分析，本课题的研究思路是利用人诱导性多能干细胞在体外首先诱导分化为生血内皮细胞，然后将富集的生血内皮与内皮微环境共培养进一步诱导其向造血干/祖细胞分化，完成其体外和体内的功能鉴定，并进一步探讨内皮微环境及其NOTCH信号通路调控造血干细胞命运决定的关键分子机制。根据课题的研究思路，我们的研究分为以下几个部分:
　　首先，利用人胚胎干细胞H9细胞系建立体外造血诱导分化体系。建立了H9细胞系以单细胞生长状态同MEF共培养的方法。利用此种生长特性的H9细胞系，建立并优化了spin EB的诱导分化体系，通过此诱导分化体系对H9细胞系进行体外造血诱导，在诱导至第12天时，通过流式细胞术检测发现CD34的表达量约15％左右，CD45的表达量约10％，实现高效率诱导H9细胞向造血细胞分化。
　　在证明了spin EB诱导分化体系的可行性后，用spin EB的诱导分化体系对携带runx1c报告基因的人诱导性多能干细胞（runx1c-hiPSCs细胞）进行诱导分化。分别在诱导分化第3、6、9、13天时，用流式细胞术对诱导分化的细胞进行表面标志物的检测发现，CD34+细胞在诱导分化第9天时能达到11％，CD45+细胞在诱导分化第13天时能达到15％。在诱导至第10天时，通过免疫磁珠分选技术(magnetic-activated cell sorting，MACS)分选富集出CD34+的生血内皮细胞。用流式细胞术对分选后的CD34+细胞检测发现，分选后的细胞CD34阳性率超过90％，分选获得的细胞能够在体外向内皮细胞和造血细胞双向分化。由于runx1c-hiPSCs细胞持续表达GFP绿色荧光，在诱导分化过程中，当造血转录因子runx1c开始表达时，细胞开始表达tdTomato橘红色荧光。这种双荧光标记的细胞能够较准确的获得诱导分化不同阶段的细胞，同时有利于进行体内移植后细胞的示踪和检测。
　　为了进一步了解内皮微环境与造血发生的关系及其可能的调控机制，利用转染了E4ORF1的人脐静脉血管内皮细胞系VeraVec建立体外诱导的内皮微环境，并将其同诱导分选出的CD34+生血内皮细胞共培养，在体外建立了内皮微环境促进内皮生血转化的研究模型，初步探讨了内皮微环境及其NOTCH信号通路促进造血转录的机制。通过流式细胞术检测发现，VeraVec细胞只表达内皮细胞标志物CD31、CD144、KDR，通过Western Blot及qRT-PCR对VeraVec及HUVEC细胞中NOTCH信号通路配体及受体表达情况进行检测后发现，VeraVec细胞中，NOTCH信号通路的配体DLL4的表达明显高于HUVEC。因此VeraVec细胞相对于HUVEC细胞而言，是更理想的共培养体系细胞，能帮助建立高表达DLL4的内皮微环境。将高表达DLL4的VeraVec细胞同分选的CD34+生血内皮细胞共培养后，发现无论是在细胞增殖或者runx1c的表达上，其都有明显的促进作用。
　　在本研究中，建立并优化了spin EB及其诱导多能干细胞分化的技术方法，能够在体外高效诱导并富集生血内皮细胞，并将生血内皮细胞与内皮微环境细胞共培养，在体外构建了内皮微环境促进内皮造血转化的研究模型，并初步研究了内皮微环境促进造血干/祖细胞分化的作用及其调控机制，为体外利用多能干细胞制备造血干/祖细胞提供了可行的方法。

目录

声明

个人简历

摘要

前言

第一章 人胚胎干细胞向造血干细胞诱导分化体系的建立与优化

第一节 人胚胎干细胞H9细胞系的培养

1 材料与方法

2 实验结果

1 材料与方法

2 实验结果

第三节 人胚胎干细胞H9细胞系spin EB诱导方法的建立与优化

1 材料与方法

2 实验结果

讨论

第二章 携带runx1c报告基因的人诱导性多能干细胞向造血干／祖细胞的诱导分化体系的建立

1 材料与方法

2 实验结果

第二节 建立spin EB体外诱导分化为生血内皮的方法

1 材料与方法

2 实验结果

1 材料与方法

2 实验结果

讨论

第三章 内皮微环境NOTCH信号通路促进多能干细胞的造血分化

1 材料与方法

2 实验结果

第二节 VeraVec内皮细胞提供的内皮微环境可能促进多能干细胞的造血分化

1 材料与方法

2 实验结果

讨论

全文总结

参考文献

附录

内皮微环境促进人诱导多能干细胞造血分化的研究

致谢

攻读硕士学位期间的成果