海带多糖LO1对慢性炎症大鼠血管内皮和脂多糖致脑微血管内皮细胞损伤的保护作用

摘要

目的:建立脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)慢性炎症大鼠模型，体外培养人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cells，HBMEC)LPS刺激模型。探讨海带多糖L01抵抗LPS炎症反应对血管内皮细胞的损伤作用及相关机制，为心脑血管疾病的防治开拓新的思路。
　　方法:(1)建立慢性炎症大鼠模型:尾静脉注射LPS(0.4mg/kg)，每周1次，共4周，以白细胞(white blood cell，WBC)计数及血清中超敏C反应蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP)含量评价炎症状态。(2)动物实验:将SD大鼠随机均分为6组，除空白对照组仅注射无菌生理盐水外，其余5组于首次注射LPS后次日，分别腹腔注射地塞米松(dexamethasone，DXM)10mg/kg，L01高、中、低剂量(50、30、10mg/kg)。LPS组注射等体积无菌生理盐水，每天给药1次，共计4周。于末次给药24h后，采用WBC计数法计数全血WBC数量;酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)测定大鼠血清中hs-CRP的含量;逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)测定内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitrie oxide synthase，eNOS)、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitrie oxide synthase，iNOS）、环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）mRNA的表达，其扩增产物于电泳后进行密度扫描及半定量分析。(3)细胞实验:体外培养HBMEC，随机分为空白对照组、LPS组、L01-H对照组、LPS+L01-L组、LPS+L01-M组、LPS+L01-H组。L01几个剂量组均先用相应剂量的L01预处理1h后，再加入LPS共培养48h。采用Griess法检测HBMEC上清中NO水平;实时荧光定量PCR技术(Quantitative Real-time PCR)检测细胞IL-6、eNOS及iNOS mRNA的表达;Western blot技术检测细胞中T-eNOS及T-iNOS的蛋白水平，以及P-eNOS Ser1177的磷酸化水平。
　　结果:(1)LPS提高大鼠全血WBC数和血清hs-CRP水平，下调eNOSmRNA表达，上调iNOS mRNA、COX-2mRNA表达。不同浓度的L01治疗性给药4周后，可拮抗这些变化。(2)LPS使HBMEC培养液中NO水平升高;使细胞中eNOS mRNA及蛋白表达下调，以及P-eNOS Ser1177的磷酸化水平下调，iNOS mRNA及蛋白表达上调。而不同浓度的海带多糖L01可逆转这些变化。
　　结论:海带多糖L01可减少LPS引起的炎症因子IL-6的释放，抑制全血白细胞数和hs-CRP含量的增加，降低细胞培养液中过量的NO表达。上调eNOS基因及其蛋白的表达，以及促进P-eNOSser1177磷酸化，下调iNOS基因及其蛋白的表达。结果提示海带多糖L01可抵抗LPS所致内皮细胞损伤，从而维护心脑血管内环境的基本稳定。

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摘要

第一部分 海带多糖对脂多糖致慢性炎症大鼠血管内皮的保护作用

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 海带多糖对脂多糖致脑微血管内皮细胞损伤的保护作用

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

全文小结

综述 内皮型一氧化氮合酶相关研究进展

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文