微流控技术制备、冷冻保存骨髓基质细胞/海藻酸微胶囊的初步研究

摘要

目的: 通过微流控技术以海藻酸包埋骨髓基质细胞(bone marrow stromal cell，BMSC)成为微胶囊(bone marrow stromal cell alginate microgel)——BMSC/ALG微胶囊，探索本体系的制备过程与构建出的细胞外三维微环境对BMSC的增殖与成骨分化活动的影响，以及探索适宜的BMSC/ALG微胶囊冷冻保存方式，为进一步探索BMSC/ALG微胶囊在组织工程方面的推广应用提供依据。 方法: 1.以微流控技术制备BMSC/ALG微胶囊，利用激光共聚焦显微镜与光学生物显微镜观察微胶囊中BMSC的存活以及生长增殖情况; 2.将BMSC/ALG微胶囊与单纯BMSC接种于细胞培养板进行普通培养，以CCK-8观察BMSC在各环境下胶囊的增殖作用; 3.成骨诱导培养BMSC/ALG微胶囊，利用光学生物显微镜观察BMSC/ALG微胶囊的矿化情况并用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、扫描电子显微镜(SEM)、能量散射x射线谱分析(EDS)对BMSC/ALG微胶囊矿化进行验证; 4.将BMSC/ALG微胶囊与单纯BMSC接种于细胞培养板进行成骨诱导培养，检测各实验组组ALP（碱性磷酸酶）的活力以比较成骨分化活性; 5.按2.5％、5％、7.5％、10％四个不同体积分数的冷冻保护液(cryoprotective agent，CPA)的浓度，以及放入程控降温盒前0min、15min、30min、45min四个不同的预平衡时间，将BMSC/ALG微胶囊分成16组进行冷冻保存。7天后复苏各组细胞，用Calcein-AM/PI染色检测细胞存活率; 6.用台盼蓝染色检测复苏后各组的细胞膜完整性; 7.常规培养24小时后用CCK-8检测各组的细胞活性。 结果: 1.存活率染色结果显示微胶囊制作后相较制作前BMSC的存活率有部分下降(P＜0.01)，但仍能保持在较高水平(86.167％±2.135)。在光学显微镜下可观察到微胶囊内的BMSC，其细胞团直径从初始((x)=15.106±1.321μm)随着培养的时间逐渐增大，在前5天的增长幅度较大，之后趋势变缓，到第8天到达峰值((x)=37.419±2.963μm)。 2.CCK-8结果显示在Day0（接种初始）微胶囊组的细胞活力略低于对照组(P＜0.01)，而在Day3、Day6、Day9两组细胞活力并无显著差异(P＞0.05)。 3.①在使用成骨诱导培养基对BMSC/ALG微胶囊进行培养后，普通光学显微镜下观察可以看到，从诱导后7天开始即可观察到BMSC/ALG微胶囊内出现矿化沉积; ②傅里叶变换红外光谱(FT-IR)检测结果显示相较成骨诱导培养前，诱导培养21天后的BMSC/ALG微胶囊中出现了磷酸盐晶体以及Ⅰ型胶原; ③扫描电子显微镜(SEM)观察发现相较成骨诱导培养前，诱导培养21天后的BMSC/ALG微胶囊表面出现大量羟基磷灰石晶体; ④能量散射光谱分析(EDS)结果可知，相较成骨诱导培养前，诱导培养21天后的BMSC/ALG微胶囊中Ca元素与P元素的含量明显增加。; 4.ALP检测显示在成骨诱导培养后的Day3与Day6，GEL组的ALP活性高于CON组(P＜0.01)，Day9时两组ALP活性无显著差异(P＞0.05)，而Day12与Day15，，CON组的ALP活性高于GEL组(P＜0.01);在以各组总DNA浓度作ALP活性的均一化后，GEL组的ALP活性在Day6与Day12略高于CON组(P＜0.01)。 5.存活率染色结果显示，使用2.5％与5％体积分数DMSO的实验组中细胞存活率随DMSO的预处理时间延长而升高(P＜0.01)，使用7.5％与10％体积分数DMSO的实验组在经过冷冻复苏后细胞存活率没有显著差异(P＞0.05); 6.台盼蓝染色结果显示，使用2.5％与7.5％体积分数DMSO的实验组中细胞膜完整率随DMSO的使用浓度升高而升高(P＜0.01)，使用7.5％与10％体积分数DMSO的实验组在细胞膜完整率没有显著差异(P＞0.05); 7.CCK-8检测显示，在使用7.5％与10％体积分数DMSO的实验组，细胞活性不存在显著差异(P＞0.05)。 结论: (1)以微流控技术制作的海藻酸BMSC/ALG微胶囊保持了BMSC的生长增殖活性，并对BMSC有促进成骨分化与矿化沉积的效果; (2)使用程控降温法冷冻保存本实验制作的BMSC/ALG微胶囊时，最优冷冻保存参数为7.5％体积分数的DMSO以及降温前，4℃环境下30分钟的渗透压平衡时间。