大鼠MCAO模型缺血半暗带相关未知microRNA鉴定及功能分析

摘要

溶栓治疗是目前缺血性卒中最为有效的治疗手段，而严格的时间窗的限制使得这一治疗手段难以普及。缺血半暗带的存在是溶栓治疗的前提。目前对缺血半暗带的判断及证实主要依赖于影像学手段，而需要特殊的设备，费用高昂，对技术水平的要求高，诊断耗时长等诸多因素使其难以大范围开展。人们在关注更加方便、快捷的影像学检测手段的同时，也一直致力于寻求一个微创，易于操作，快速，价格经济的基于血液的生物标志物。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类内源性的核酸小分子，参与了脑缺血发生和发展的多种病理生理过程，是缺血半暗带潜在的生物标志物。本研究主要是通过对大鼠永久性大脑中动脉阻塞(permanent middle cerebral artery occlusion，p-MCAO)模型缺血半暗带相关microRNA表达谱进行分析，预测新的microRNA，从中找出差异表达的miRNA并进行鉴定，并对其功能进行分析，探讨其作为缺血半暗带相关的血液标志物的潜在价值。 第一部分 大鼠p-MCAO模型缺血半暗带未知miRNA的鉴定 目的：对大鼠p-MCAO模型缺血半暗带及正常脑组织的miRNA表达谱进行深度测序分析，并预测其中的未知miRNA序列，对其可能的二级结构、物种保守性进行分析，找出差异表达的未知miRNA并进行荧光定量PCR的验证。 方法：(1)将SD雄性大鼠随机分4组;①假手术组;②脑缺血1小时组;③脑缺血3小时组;④脑缺血4小时组;分别在假手术后、p-MCAO造模后1小时、3小时和4小时快速采集静脉血样本，随后断头取脑，自大脑底视交叉处作一冠状切线，往尾侧方向约2mm再作冠状切开，取中间大脑切片，然后沿中线右侧旁开约2mm作一纵切线，在大约2点钟方向的皮质部分作一斜切线将半暗带与梗死中心区分离，取纵切线与斜切线之间的皮质区域即半暗带组织。用Trizol法提取血液及半暗带组织总RNA用于深度测序检测并预测新miRNA;用R语言的edgeR软件包的计算差异表达的新miRNA;用实时荧光定量PCR(qPCR)进行差异表达验证及在各个组织器官中的表达。 结果：本研究通过对测序数据的分析，获得了不同时间点大鼠p-MCAO缺血半暗带样本miRNA表达谱，其中未能比对上的序列占32.89％。经过对新miRNA的预测及分析其中差异表达的miRNA，共得到9个在各个组样本均有表达的序列，rno-miR-686-3p(xxx-m0128-3p)具有稳定的二级结构，在物种进化上具有高度的保守性，结合q-PCR产物克隆和测序分析结果证实rno-miR-686-3p是新miRNA，q-PCR显示半暗带组织中miR-686-3p在1小时出现明显下调(P=0.042)，后持续降低，3小时组下调(P=0.032)，4小时组达最低水平(P=0.007)。在1小时组、3小时、4小时组和4小时组中，miR-686-3p的表达分别减少到大约54％、57％和76％。q-PCR结果证实了这个rno-miR-686-3p在胰腺组织和脑组织的表达量较高。在外周血中，mir-686-3P在1小时组的表达水平与假手术组相比有显著增加(P=0.015)，是假手术组的2.8倍（图3。D）而3小时和4小时组与假手术组相比没有显著的差异。 结论：rno-miR-686-3p是一结构典型，物种进化上具有高度保守的新miRNA，rno-miR-686-3p有一定的脑组织特异性，其表达水平在半暗带中随着缺血时间延长而降低。而在外周血中，在缺血1小时组miR-686-3p的表达水平明显升高。据此我们推测，外周血miR-686-3p的高表达提示缺血损伤处于超早期，并可能与半暗带的存在有关。因此，miR-686-3p对于判断缺血半暗带的存在，急性脑梗死患者预后的评估，预先对血管再通治疗效果的评价具有潜在的价值。 第二部分 mir-686-3p在缺血半暗带中的定位及其相关功能的生物信息学分析 目的：利用原位杂交技术了解rno-miR-686-3p在不同分组大鼠缺血半暗带中的表达及分布情况;利用生物信息学方法对rno-miR-686-3p的靶基因进行预测，并对预测到的靶基因进行GO富集分析及KEGG通路富集分析。 方法：按照第一部分的分组方法将SD大鼠分为4组，在假手术后、p-MCAO造模后1小时、3小时和4小时用4％多聚甲醛PBS缓冲液行心脏灌注，断头取脑后按照第一部分的方法取出脑缺血半暗带组织进行石腊包埋。使用地高辛标记锁定的寡核苷酸探针(Locked Nucleic Acid，LNA)进行原位杂交反应。用imageJ1.48v图像分析软件计算出每张图片的平均光密度(mean optical density，MOD)。运用miRDB网站工具对rno-miR-686-3p靶基因进行预测。将预测到的靶基因通过DAVID网站工具进行GO结点和KEGG通路富集分析。 结果：rno-miR-686-3p主要较均匀分布在大脑皮质细胞核。在各个时间点半暗带区域的原位杂交切片中，相对于对照组，miRNA686-3p的杂交信号逐渐衰减，在对各组图像染色的平均光密度值计算后进行统计学分析，各组图像的平均光密度值存在显著差异(p＜0.001);组间两两比较，与对照组相比，1小时组平均光密度值显著降低(p=0.001)，3小时与4小时组平均光密度值显著降低(p＜0.001);与1小时组相比，3与4小时组小时组平均光密度值显著降低(p=0.003，p＜0.001);与3小时组相比，4小时组小时组平均光密度值显著降低(p=0.022)。使用miRDB在线工具预测了了297个rno-miR-686-3p潜在的靶基因。对靶基因进行富集分析，3个富集程度最高的功能依次是参与转录的调节(DNA-模板)(10.76％，p=5.24×10-5)，RNA聚合酶Ⅱ启动子的正调控(9.72％，p=4.32×10-4)和参与转录(DNA-模板)(7.6％，p=0.0016)。参与经典Wnt信号通路的负调节(2.43％，p=0.0021)，参与cAMP介导的信号通路(1.39％，p=0.001)也被功能富集结果当中。此外，我们所关注的对于细胞凋亡信号传导途径(1％，p=0.09)的生物过程的正向调控也被富集。KEGG通路富集结果包含了6条通路（表3）富集程度高的前三条通路分别是结直肠癌信号通路(1.74％，p=0.05);Wnt信号通路(2.08％，p=0.019);黏蛋白型O-聚糖生物合成通路(1.04％，p=0.037)。cAMP-信号通路(2.08％，p=0.062)也在富集的通路之中。 结论：rno-miR-686-3p主要分布在大脑皮质细胞核，随着缺血时间的延长，miR-686-3p在半暗带中的表达持续下降，能够代表脑内缺血半暗带的变化。rno-miR-686-3p可能参与转录调节，还可能对凋亡信号通路的生物过程进行正向调控，因此，它的表达下调可能是由于机体对于缺血梗死后凋亡的一种保护机制，并可能参与调节经典的Wnt信号通路和cAMP信号通路。