VEGF基因转染恢复小鼠口腔黏膜下纤维化血管生成的实验研究

摘要

背景:由于血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)与口腔黏膜下纤维化(oral submucous fibrosis，OSF)后期血管减少有着密切关系，且目前应用VEGF基因转染恢复血管生成技术较为成熟。在前期小鼠OSF模型成功构建的基础上，本实验拟采用VEGF基因转染恢复小鼠口腔黏膜下纤维化血管生成。
　　目的:(1)通过AD-EGFP-VEGF165(adenovirus-enhanced green fluorescent protein-vascular endothelial growth factor165，携带人血管内皮细胞生长因子165基因及绿色荧光蛋白的腺病毒），体外转染小鼠成纤维细胞，观察转染效率及转染前后VEGF表达情况。(2)通过小鼠颊黏膜下组织注射AD-EGFP-VEGF165，了解VEGF基因转染法恢复小鼠OSF血管生成的有效性以及可行性。
　　方法:(1)体外培养小鼠颊部成纤维细胞，并将已构建成功的AD-EGFP-VEGF165、AD-EGFP(adenovirus-enhanced green fluorescent protein，携带绿色荧光蛋白的腺病毒)分别转染细胞，通过RT-qPCR、ELISA检测转染前后VEGF的表达量，MTT检测转染后细胞的增殖活力。(2)将40只小鼠随机分为实验组30只，对照组10只，对照组自由饮用无菌水，实验组自由饮用无菌水配成1000mg/L的槟榔碱溶液，20周后，随机取两组小鼠各5只，取其颊部组织通过H.E（Hematoxylin and eosin staining，苏木素-伊红）、Masson、V-G(Van Gieson)染色，观察其组织结构，确定OSF样改变，为后期动物实验奠定基础。(3)将15只OSF小鼠随机平均分成3组，将等量的AD-EGFP-VEGF165、AD-EGFP、生理盐水分别注射于OSF小鼠颊黏膜下组织，观察转染前后各组VEGF表达以及局部组织血管生成情况。
　　结果:(1)当用MOI(multiplicity of infection，感染复数)=100的腺病毒转染小鼠成纤维细胞72h后，转染效率最高。RT-qPCR和ELISA结果示:AD-EGFP-VEGF1。5转染成纤维细胞72h后均可有效表达VEGF(p＜0.05);ELISA检测培养1周细胞上清液中VEGF蛋白变化，结果示:其蛋白含量在第6天达高峰。MTT结果示:转染组(AD-EGFP-VEGF1。5)与未转染组细胞吸光光度值无明显差异(p＜0.05)。(2)槟榔碱饮水法喂养小鼠20周后，实验组小鼠颊部组织可见OSF样改变。(3)注射OSF小鼠颊黏膜下组织6天后，实验组AD-EGFP-VEGF165组可有效表达VEGF(p＜0.05)，并且颊黏膜下组织可见VEGF阳性表达，而AD-EGFP组和生理盐水组未见阳性表达。CD34染色后，实验组AD-EGFP-VEGF165组微血管数量较对照组以及转染前明显增加(p＜0.05)。
　　结论:(1)MOI值为100时，AD-EGFP-VEGF165转染小鼠成纤维细胞后，可有效表达VEGF且不影响细胞生物学特性。(2)槟榔碱饮水法喂养小鼠20周后，实验组小鼠颊部组织可见OSF样改变。(3)AD-EGFP-VEGF165转染OSF小鼠颊黏膜下组织后，可有效表达VEGF并促进局部血管生成。

目录

声明

个人简历

摘要

1．前言

2．材料和方法

2．1 实验动物

2．2 试剂和仪器

2．3 实验方法

2．4 评判标准

2．5 统计学分析

3．结果

3．1 小鼠原代成纤维细胞培养

3．2 小鼠原代成纤维细胞鉴定

3．3 腺病毒转染小鼠成纤维细胞

3．4 AD-EGFP-VEGF165转染小鼠成纤维细胞前、后细胞培养上清液中人VEGF蛋白表达差异对比

3．5 AD-EGFP-VEGF165转染小鼠成纤维细胞前、后细胞培养上清中的鼠VEGF表达差异对比

3．6 RT-qPCR检测各组细胞中VEGF165 mRNA表达量

3．7 细胞VEGF免疫组化

3．8 ELISA法检测转染后细胞上清液中人VEGF一周表达变化

3．9 转染AD-EGFP-VEGF165对成纤维细胞的增殖影响

3．10 小鼠颊组织切片染色

3．11 OSF小鼠口腔颊黏膜下组织注射

3．12 ELISA检测组织转染后第6天人VEGF

3．14 OSF小鼠颊组织转染6天后免疫组化检测

4．讨论

4．1 成纤维细胞与OSF

4．2 VEGF与血管生成

4．3 目的基因转染成纤维e_Wllg

4．4 目的基因转染OSF小鼠颊黏膜下组织

4．5 总结

5．结论

参考文献

附录

综述 槟榔引发口腔组织病变的研究进展

致谢

攻读学位期间发表的论文