高血钾预处理对心脑缺血再灌注损伤的作用及其机制研究

摘要

目的：在细胞及器官层面上的研究已证实，高血钾能通过拮抗钙超载途径达到减轻心肌缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury,IRI)的作用，但高血钾是否也能减轻脑的IRI，目前尚未有相关研究证实。在临床工作中，患者出现心跳骤停(cardiac arrest，CA)以及医护人员对其所实施心肺复苏(cardiopulmonary resuscitation，CPR)的抢救过程，本质上复制了一个全身器官、组织的IRI模型。在CA/CPR背景下，高血钾是否也能在整体层面上减轻全身器官、组织、特别是心和脑的IRI，进而改善CPR的疗效，目前尚未有文献报道。 本研究通过临床病例的回顾和观察，探索高血钾引起的CA患者经长时间CPR抢救后能够复苏成功、且不遗留神经系统损害的潜在机制，提出高血钾对心脑缺血再灌注损伤可能具有一定的保护作用的科学假设;通过应用实验研究的手段，从整体、器官和分子生物学等不同层面上验证该假设，为提高CPR成功率及CPR成功后脑保护的研究提供新的思路。 方法：1、具体回顾两例临床上因高钾血症致CA的患者，经长时间CPR后恢复自主循环(restoration of spontaneous circulation，ROSC)、且无明显神经系统损害的病例，结合临床特点及相关文献，分析潜在可能的病理生理机制。 2、研究高血钾预处理对SD大鼠CPR效果及心肌顺应性的影响：将90只雄性SD大鼠随机分成高血钾预处理组和对照组(45只/组)，通过静脉途径预先分别予氯化钾(potassium chloride，KCl)80ug/g或等量生理盐水(normal saline，NS)干预，监测心电和动脉血压。两组大鼠均接受相同的电刺激法诱导心室颤动、建立CA/CPR模型;根据CA持续时间的不同(6min、9min和12min)，将每组CA大鼠按抽签法进一步分成3个亚组（15只/组），在经历各自CA持续时间后开始CPR。统计各组大鼠复苏成功率和CPR时间;对复苏失败的大鼠，记录终止CPR前按压状态下的舒张压，并立即进行尸检，进行心脏硬度评分并统计各组大鼠“石头心”的发生率。 其中，诱发CA的标准：心电监护显示心室颤动或无脉性电活动、有创血压监测显示无搏动波，平均动脉压＜10mm Hg。CA持续时间：自电刺激诱发CA开始到CPR开始的时间。ROSC的标准：心电监护示室上性节律（包括窦性、房性或交界性心律）伴有平均动脉压≥50mmHg，持续5min以上。CPR时间：自CPR开始到ROSC的时间。复苏失败的定义：持续CPR10min未能ROSC。“石头心”的定义：根据指尖接触心脏体感的不同，将心脏硬度分为5级，每级记1分，最高5分，评分越高心脏硬度越大，心脏硬度评分≥3分定义为形成“石头心”。 3、研究高血钾预处理对SD大鼠局灶性脑IRI及钙超载的影响：将120只雄性SD大鼠随机分为4组(30只/组)：高血钾80ug/g预处理(HK80)组、高血钾40ug/g预处理(HK40)组、NS组和假手术组。除假手术组外，其他3组大鼠通过静脉途径预先分别予KCl80ug/g、40ug/g或等量NS，然后采用tMCAO建立大鼠局灶性脑IRI模型，在大鼠脑局灶缺血90min后予再灌注24h。观测高血钾预处理组大鼠的神经功能评分、脑梗死范围、脑组织切片镜下形态、脑组织K+、C a2+和钙调蛋白(calmodulin，CaM)浓度，Ca-ATPase活性及钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ)和钠钙交换体(Na+/Ca2+exchanger，NCX)1蛋白免疫印迹表达情况与NS组和假手术组比较是否有差异。 结果：1、两位患者都有发生高钾血症的明显诱因和伴发疾病，发病时都有意识丧失和CA、都经历了长时间的CPR(45分钟和197分钟)，但ROSC后都无明显神经系统损害;分析其机制可能与高血钾在一定程度上拮抗心脑钙超载、减轻IRI有关。 2、CA/CPR模型 在电刺激诱发大鼠CA后，随着CA持续时间的延长，高血钾预处理组与对照组中复苏成功大鼠的数量减少;比较各CA持续时间亚组大鼠的复苏成功率，高血钾预处理组均高于对照组：CA6min，高血钾预处理组大鼠全部复苏成功(100％)，对照组有8只大鼠复苏成功(53.3％);CA9min，高血钾预处理组有9只大鼠复苏成功(60.0％)，对照组有2只大鼠复苏成功(13.3％);CA12min，高血钾预处理组有5只大鼠复苏成功(33.3％)，而对照组大鼠全部复苏失败。在CPR所需时间上，各相同CA持续时间亚组对比，高血钾预处理组CPR时间均明显少于对照组(CA6min：1.17±0.41vs6.39±0.74，P＜0.05;CA9min：3.33±0.83vs7.85±0.92,P＜0.05)。 在CA9min和12min复苏失败的大鼠中，高血钾预处理组大鼠的心脏硬度评分均低于对照组(CA9min：1.7±0.6vs4.2±0.7，P＜0.05;CA12min：1.9±0.7vs4.7±0.5，P＜0.05)，高血钾预处理组大鼠“石头心”的发生率也明显低于对照组(CA9min：0vs100％，P＜0.05;CA12min：20.0％vs100％，P＜0.05)。终止CPR前通过按压得到的舒张压(mmHg)对比，高血钾预处理组明显高于对照组(CA9min：26.4±5.3vs-1.2±3.8，P＜0.05;CA12min：26.2±5.2vs-1.1±3.3，P＜0.05)，提示经高血钾预处理大鼠的心肌仍有一定的顺应性、维持一定的舒张功能，而对照组大鼠在终止CPR前未能通过按压维持一定的舒张压，其舒张压甚至出现负值。 3、tMCAO模型 再灌注24h后，高血钾预处理组(HK80和HK40)大鼠神经功能评分明显高于NS组(HK80vs NS：15.17±2.03vs12.67±1.49，P＜0.05;HK40vs NS：14.83±1.07vs12.67±1.49，P＜0.05)。高血钾预处理组大鼠脑组织染色后的梗死范围(％)明显小于NS组(HK80vs NS：8.72±1.62vs20.71±3.04，P＜0.05;HK40vs NS：13.29±2.07vs20.71±3.04，P＜0.05);且HK80组大鼠的脑梗死范围(％)小于HK40(HK80vs HK40：8.72±1.62vs13.29±2.07，P＜0.05)。镜下观察各组大鼠脑组织切片，相比于NS组，高血钾预处理组镜下显示更规则的细胞排列和更少的核固缩。 在大鼠脑组织生化指标的测定中，再灌注24h后高血钾预处理组较NS组大鼠脑组织的K+浓度更高(HK80vs NS：1.2112±0.0155vs0.9789±0.0368，P＜0.05;HK40vs NS：1.0461±0.0410vs0.9789±0.0368,P＜0.05)、Ca2+浓度(HK80vs NS：0.0971±0.001vs0.1406±0.001,P＜0.05;HK40vs NS：0.1121±0.001vs0.1406±0.001,P＜0.05)和CaM浓度(HK80vs NS：59.5432±4.6084vs72.3386±3.5612,P＜0.05;HK40vsNS：62.5883±4.5471vs72.3386±3.5612，P＜0.05)更低，Ca-ATPase的活性更高(HK80vs NS：4.3129±0.2454vs3.4213±0.2941,P＜0.05;HK40vs NS：3.9456±0.2681vs3.4213±0.2941，P＜0.05)，同时CaMKⅡ(HK80vs NS：0.731±0.061vs0.964±0.059,P＜0.05;HK40vs NS：0.456±0.042vs0.964±0.059,P＜0.05)和NCX1(HK80vs NS：0.348±0.043vs0.463±0.072,P＜0.05;HK40vs NS：0.423±0.066vs0.463±0.072，P＜0.05)蛋白免疫印记的表达高血钾预处理组较NS组明显下调。上述指标在两个高血钾预处理组之间无明显统计学差异，但在钾浓度更高的HK80组表现出更好的趋势。 结论：高血钾预处理能提高SD大鼠心、脑组织对IRI的耐受性，通过拮抗钙超载途径提高CA/CPR大鼠复苏成功率、缩短CPR时间、改善大鼠心肌顺应性、减少CPR过程中“石头心”的发生率，并能通过抑制钙超载减轻大鼠局灶性脑IRI。 本研究在一定程度上解释了文中提到的两位高钾血症致CA患者，经历长时间CPR的复苏效果相对较好的原因，也为今后探索如何提高CPR疗效、减轻CPR后脑损伤提供一条新思路。