小鼠胚脑内DISC1基因功能干扰对成年后行为、脑代谢和中间神经元发育的影响

摘要

精神疾病如精神分裂症(schizophrenia，SCZ)和重度抑郁障碍(majordepression disorder，MDD)是破坏性脑部疾病。SCZ的风险基因——精神分裂症1(disrupted in schizophrenia1，DISC1)，与神经精神病学状况有关。然而，关于早期生命中胎儿NPC(Nuclear Pore Complex，核孔复合体)的遗传损伤对脑代谢和行为结果的长期持续影响，我们知之甚少。我们已经建立了一种新的小鼠模型，通过具有精确时间和空间调控的显性负DISC1(dominant-negative DISC1，DN-DISC1)在体内特异性地干扰NPC中的DISC1功能。令人感兴趣的是，NPC中DISC1功能的产前干扰导致成年小鼠异常抑郁样缺陷。在这里，我们采取了一种新的无偏差的代谢组学方法来鉴定在DN-DISC1小鼠中显著变化的脑特异性代谢物。令人惊讶的是，抑制性神经递质GABA(Gammer Amino Butyric Acid，氨基丁酸)出现增加。与此一致，扣带皮质、反循环颗粒皮质和运动皮质中的小清蛋白(parvalbumin，PV)中间神经元也出现增加。有趣的是，生长抑素(somatostatin，SST)阳性和神经肽Y(neuropeptide Y，NPY)中间神经元在一些脑区域减少，表明DN-DISC1的表达影响中间神经元亚型的定位。为了进一步探索导致这种变化的细胞机制，使DN-DISC1抑制增殖并促进内侧神经节隆突(medial ganglionic eminence，MGE)中祖细胞的细胞周期退出，而通过细胞非自主作用刺激相邻细胞的异位增殖。在机制上，它调节GSK3β活性并破坏Wnt活化中的Dlx2活性。总之，我们的研究结果提供证据表明，在短时间内对NSC（neural stem cell，神经干细胞）的特定遗传损伤可能导致脑代谢和发育的长期变化，最终导致行为缺陷。
　　实验内容包括以下三部分:
　　第一部分 建立新的Nes-DN-DISC1转基因小鼠模型及行为测试
　　目的：
　　建立新的Nes-DN-DISC1转基因小鼠模型;检测Nes-DN-DISC1小鼠E17胚脑的DN-DISC1 Western印迹;测试Nes-DN-DISC1转基因小鼠模型的行为。
　　方法：
　　1.将Nes-rtTA-GFP小鼠与teto-DN-DISC1小鼠配对以产生Nestin-rtTA-GFP和teto-DN-DISC1(Nes-DN-DISC1)双转基因品系。对于Nes-rtTA-GFP小鼠，使用rtTA引物(5'-GGA CAA GAG CAA AGT CAT AAA CGG-3'和5'-TTC GTACTG TTT CTC TGT TGG GC-3')进行基因分型，对于Teto-DN-DISC1小鼠，使用TRE-DISC1引物（TRE-CMV-F4:5'-gacctccatagaagacaccgggac-3'，和TRE-hDISC1-R2:5'-tgagctgaatcccaaagtgcgccg-3'）进行基因分型。
　　2.将E17胚鼠的大脑切片免疫组织化学染色;将来自E17诱导或未诱导的脑的脑细胞裂解物进行裂解并用小鼠抗myc(DSHB)和小鼠抗肌动蛋白(GenScript)抗体印迹标记，所有的图片均使用Zeiss LSM Pascal共聚焦显微镜获取并使用ZeissLSM图像浏览分析软件和图像分析软件分析。数据分析使用T-test分析，所有的柱状图使用均数士标准差显示。所有的分析中，p＜0.05表示差异有统计学意义。
　　结果：
　　1.我们通过杂交Nes-rtTA转基因小鼠建立了一种新的Nes-DN-DISC1转基因小鼠模型，该小鼠模型中GFP和rtTA由巢蛋白启动子驱动，而teto-DN-DISC1小鼠品系的DN-DISC1由多西环素(doxycycline，Dox)诱导型启动子(teto)控制。该小鼠品系提供了一种空间控制，因为该转基因仅在巢蛋白启动子控制的NPC中被开启。Dox还提供DN-DISC1表达的时间控制。
　　2.Nes-rtTA小鼠品系提供GFP报道分子来特异性标记胚胎脑中的NPC。脑室区(ventricularzones，VZ)和室下区(subventricularzones，SVZ)的新皮质NPC产生皮质投射神经元。神经节隆突(ganglionic eminence，GE)中的内膜细胞祖细胞(interneuron progenitor cells，IPC)的皮层中间神经元切向迁移到发育中的皮层的边界，在那里它们成熟并形成具有兴奋性神经元的功能网络。
　　结论：
　　1.建立新的Nes-DN-DISC1转基因小鼠模型。
　　2.Nes-DN-DISC1小鼠胚脑的DN-DISC1表达在E17被诱导。
　　3.小鼠胚脑内NPC早期遗传损伤可能在成年期表现出长期的行为异常风险，即使风险被消除。
　　第二部分 NPC中DISC1功能产前干扰后对代谢组学及对中间神经元的影响
　　目的：
　　检测NPC中DISC1功能产前干扰后对代谢组学的影响;检测Nes-DN-DISC1小鼠中间神经元的变化;测试胚胎NPC中DN-DISC1的表达对神经网络发育的影响。
　　方法：
　　在第1天或第30天CO2窒息后立即收集脑和肝。制备NMR光谱的样品，1HNMR光谱检测，光谱数据处理和多变量数据分析，我们利用无偏差的代谢组学方法（NMR）来确定详细的代谢物变化。使用来自不同年龄的对照组小鼠和Nes-DN-DISC1小鼠的肝和脑组织提取物进行具有判别分析的潜在结构的成对比较正交投影(orthogonal projection to latent structures withdiscriminant analysis，OPLS-DA)。从每个基因型的8只小鼠中收集数据。我们从E0到P0进行了DN-DISC1诱导，然后检测了两个月龄的转基因小鼠的总脑结构。收集16天胚鼠大脑并进行固定、冰冻切片，大脑切片免疫组织化学染色，检测胚鼠大脑皮层中间神经元的表达。
　　结果：
　　1.与对照小鼠相比，出生后1天(P1)，Nes-DN-DISC1小鼠肝脏中延胡索酸、胆碱和葡萄糖水平较低。然而，在P30，在对照小鼠和Nes-DN-DISC1小鼠肝脏之间没有观察到代谢物的显著差异。
　　2.有趣的是，P30与P1相比，Nes-DN-DISC1小鼠表现出脂质、3-HB、肌酸、不饱和脂肪酸和一些氨基酸水平的显著升高，包括谷氨酸、甘氨酸、酪氨酸、组氨酸和苯丙氨酸，而次黄嘌呤与肝脏中丙氨酸、谷胱甘肽、胆碱、葡萄糖和AMP的水平降低。
　　结论：
　　证实NMR可以检测小鼠肝脏代谢物的年龄相关变化。胚胎NPC中的DN-DISC1表达改变了脑和肝中的代谢物，并对成年后行为产生长期的影响。DN-DISC1的表达没有引起大脑体积、皮质厚度以及皮质和海马体总细胞密度的明显变化。Nes-DN-DISC1小鼠的抑郁行为不是由成熟神经元异常引起的。DN-DISC1在胚胎NPC中的表达改变成年后大脑中的GABA能抑制性神经元分布。
　　第三部分 DN-DISC1调节中间神经元发育的分子机制
　　目的：
　　探讨DN-DISC1表达是如何影响中间神经祖细胞的发育;为了检测DN-DISC1调节MGE祖细胞增殖的机制，我们检测了细胞周期退出指数。检测DN-DISC1表达对Wnt信号的影响。
　　方法：
　　1.DNA质粒构建通过PCR扩增人类全长的DN-DISC1，并将其亚克隆到3×FLAG表达载体中。Super8×TOPFLASH（其中包含8个TCF/LEF结合位点）和一个Renilla-Luc-TK报告基因(pRL-TK，Promega)用于测试TCF转录活性。
　　2.荧光素酶检测将N2a细胞接种到24孔板中，使用聚乙烯亚胺和0.2μg的8×TOPFLASH报告基因、0.05μg的pRL-TK、0.4μg的WT-DISC1或DN-DISC1以及0.4μg的小鼠DLX2对细胞进行转染。转染后24小时，使用双荧光素酶检测系统(Promega)检测TCF报告基因活性。
　　结果：
　　1.与SCZ患者脑中一致的发现是，小鼠胚脑内PV中间神经元减少，其来自内侧GE(medial GE，MGE)。与对照小鼠相比，Nes-DN-DISC1小鼠的MGE中GFP阳性NPC的数量显著减少。DISC1功能干扰大大降低了MGE区域的NPC增殖(＞60％)。我们观察到在Nes-DN-DISC1小鼠的MGE，GFP阴性（例如巢蛋白阴性）的异位pH3阳性细胞增加了2倍以上。
　　2.GFP+/BrdU+/Ki67+细胞在E15处于S期，并在E16保持循环。GFP+/BrdU+/Ki67-细胞在E15处于S期，但到E16退出细胞周期。细胞周期退出指数表示GFP+/BrdU+/Ki67-细胞与总GFP+/BrdU+细胞的比例。
　　结论：
　　DN-DISC1表达具有抑制GFP+ NPC增殖的作用，而表现出促进相邻祖细胞增殖的作用;DN-DISC1通过其对内源性DISC1的显性负效应抑制Wnt信号通路活化;DN-DISC1负调控Dlx2介导的Wnt信号通路活化，阻碍Dlx2在中间神经元发育中的作用。

目录

声明

个人简历

摘要

引言

第一部分 建立新的Nes-DN-DISC1转基因小鼠模型及行为测试

1．实验材料与方法

2．结果

3．讨论

4．结论

第二部分 NPC中DISC1功能产前干扰后对代谢组学及对中间神经元的影响

1．实验材料与方法

2 结果

3．讨论

4．结论

第三部分 DN-DISC1调节中间神经元发育的机制

1．实验材料与方法

2 结果

3．讨论

4．结论

结语

参考文献

综述 DISC1基因在神经元传递中的作用及其对神经行为表现和神经治疗的影响

英汉缩略语名词对照

致谢

攻读学位期间发表的学术论文