V-ATPase V1G1亚基在肝癌中的表达及其功能的研究

摘要

目的:在全球常见的癌症中,肝癌由于其进展快,预后差,且无论其近期的治疗方案和早期鉴定进展如何,仍然是全球癌症死亡的第三大原因。肝癌的发病机制非常复杂,包括病毒感染、黄曲霉毒素摄入、基因遗传、饮水、吸烟及饮酒感染等多种因素,迄今为止,仍未能完全阐明。并且,虽然已经发展了多种颇有疗效的治疗方案,但还没有任何一个方案可以满足肝癌的治疗。V-ATPase在真核细胞中广泛表达,是由14个亚基组成的质子泵,只有V0和V1亚单位相结合才能发挥其蛋白酶的作用。V-ATPase通过分解ATP获得能量,主动转运H+,其作用不仅包括维持细胞内外pH值的平衡、受体介导的内吞作用、细胞内靶向溶酶体酶、蛋白加工和脱粒及小分子的双向转运等,还是肿瘤微环境中重要的调节器,能够将癌细胞内多余的H+泵出胞外或管泡中,以维持胞质和细胞器pH值的稳定。本文研究目的是探讨V-ATPase亚基之一ATP6V1G1在肝癌组织和肝癌细胞中的表达水平,明确ATP6V1G1过表达后对肝癌细胞生物学功能的影响。
　　方法:本研究第一部分通过qRT-PCR和免疫组化检测人肝癌组织标本及配对的癌旁组织标本中ATP6V1G1的mRNA表达情况,并结合临床资料分析ATP6V1G1的表达与相关临床病理特征之间的关系;同时运用qRT-PCR检测SMMC-7721肝癌细胞株、HCC-LM3肝癌细胞株、L02正常肝细胞株中ATP6V1G1的mRNA表达水平。第二部分构建ATP6V1G1过表达的SMMC-7721、HCC-LM3肝癌细胞稳转株,每种细胞各分为对照组、病毒空载组、过表达组三组,采用qRT-PCR及Western-blot分别检测三组细胞中ATP6V1G1的mRNA表达水平和Flag蛋白的表达情况,运用细胞单克隆形成实验检测细胞的克隆能力,并进行CCK8实验检测细胞的增殖能力,利用Transwell实验检测各组细胞的迁移和侵袭情况,最后通过流式细胞周期实验检测各组细胞的周期情况。采用SPSS16.0统计学软件进行统计分析,P＜0.05被认为具有统计学差异。
　　结果:1.免疫组化显示ATP6V1G1的表达主要定位于胞浆中,根据免疫组化结果评分划分,本组56例患者的肝癌组织中25例高表达(44.6％),31例低表达(55.4％),而相应的癌旁组织中,12例高表达(21.4％),44例低表达(78.6％),与癌旁组织相比,肝癌组织中ATP6V1G1的表达水平明显升高(P＜0.05);结合临床病理资料分析发现ATP6V1G1免疫组化的表达与肿瘤直径、包膜的有无之间有关(均为P＜0.05);对31例肝癌组织和对应癌旁组织进行qRT-PCR检测发现,与对应的癌旁组织相比,ATP6V1G1在肝癌组织中表达水平呈上升趋势,差异具有统计学意义(P＜0.05);对两种不同肝癌细胞株SMMC-7721和HCC-LM3进行qRT-PCR检测发现,三组间均有显著的统计学差异(P＜0.05),SMMC-7721和HCC-LM3分别是正常肝细胞株L02的2.63倍和5.03倍,表达水平明显升高。
　　2.7721和LM3中,过表达组的mRNA表达量均显著高于对照组和病毒空载组(均为P＜0.05),WB实验中过表达组出现Flag蛋白条带,表明ATP6V1G1过表达的SMMC-7721、LM3肝癌细胞稳转株构建成功;过表达组的细胞克隆数量均明显高于其他两组(P＜0.05);CCK8实验发现,过表达组的细胞增殖能力均比其他两组要高(均为P＜0.05);Transwell实验表明,过表达组的迁移和侵袭能力均比另外两组要强(P＜0.05);流式细胞周期实验发现,ATP6V1G1过表达可使7721细胞阻滞于G2/M期,即细胞分裂能力增加,并减短S期,促进细胞的生长代谢,同时使LM3的G0/G1期阻滞,S期减短,发挥促癌作用,不同侵袭性的肝癌细胞中,ATP6V1G1过表达对细胞周期影响的具体机制具有一定的差异。
　　结论:1.ATP6V1G1在肝癌组织免疫组化中的表达水平升高,且其高表达与肿瘤生长的直径和包膜有无之间密切相关;ATP6V1G1在肝癌细胞中的表达水平显著升高,且随着肿瘤细胞侵袭性的增加而增加;提示其表达水平可成为评估肝癌患者发病及转移风险的潜在生物学指标;2.ATP6V1G1过表达对肝癌细胞的单克隆形成能力、细胞增殖能力、细胞迁移及侵袭能力均有促进作用,表明ATP6V1G1参与到肝癌细胞的生长发展以及转移侵袭等各个环节中并发挥促癌作用,为肝癌的发生发展提供了理论依据。本研究提示V-ATPase可以成为颇有前景的抗肝癌治疗的新型靶点。

目录

声明

个人简历

摘要

第一部分 ATP6V1G1在肝癌中表达水平的检测

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 过表达ATP6V1G1肝癌稳转株的构建及其功能的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

全文总结

附录

综述 V-ATPase在肿瘤中的研究进展

致谢

攻读学位期间发表的学术论文