几种呼吸道传染病病毒的微流控等温扩增荧光检测技术研究

摘要

近几年来，频繁暴发的呼吸道传染病疫情严重危害公众健康。2005年暴发的H5N1禽流感，波及17个省市，造成13人死亡。2009年暴发自墨西哥的甲型H1N1流感疫情造成全球恐慌。2013年暴发于中国东部的H7N9禽流感疫情再次引起了全世界的关注。此外，近年来在我国流行的7型、14型和55型腺病毒已造成聚集性暴发疫情。呼吸道传染病现场检测技术的不足，严重影响疫情应急处置的时效性和针对性。
　　目的:快速检测呼吸道传染病病原体是及时发现传染源、采取有效隔离措施，防止疫情蔓延的关键，是呼吸道传染病疫情科学防控的迫切需要。本研究拟建立基于微流控芯片和等温扩增技术的的呼吸道病原体现场快速检测技术，解决当前呼吸道传染病现场检测技术缺乏，难以满足呼吸道症候群主要病原筛查的问题;为及时准确治疗和隔离传染源，实现疫情的及时有效科学防控提供技术支持。
　　方法:首先，在GenBank中查找甲型H1、H3、H5、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒以及副流感病毒的保守序列，设计其特异性LAMP引物，根据扩增效果筛选出最佳引物，建立并优化常规荧光LAMP体系。其次，设计阵列化微流控芯片，研究等温扩增用酶、引物、缓冲液等扩增试剂在微流控芯片内的固定方法和扩增性能，建立微流控等温扩增荧光检测方法。考察并优化有关参数，重点研究核酸扩增的防污染技术，减少等温扩增的假阳性，评价所建立检测方法的特异性和灵敏度，以及临床样本检测能力。
　　结果:在常规荧光LAMP检测方法的基础上，优化获得微流控等温扩增荧光检体系，采用1.25μL Eva Green在65℃条件下30min内即可完成扩增反应，建立了微流控等温扩增荧光检测技术。特异性评价结果表明，该方法可实现甲型H1、H3、H5、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的特异性检测。芯片各反应孔独立，每个反应孔仅需3μL反应体系，无交叉反应;在一张芯片上可以完成这7种病原体的分型检测。该微流控等温扩增荧光检测方法对H1、H3和腺病毒的灵敏度为10copies/μL，对H5亚型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒的检测灵敏度可达100copies/μL。
　　结论:本研究建立的微流控等温扩增荧光检测方法可实现扩增结果的荧光实时判读，操作便捷，无需热循环;可完成甲型H1、H3、H5、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒以及副流感病毒的特异性扩增;检测灵敏度高达10-100copies/μL;试剂用量小，检测成本低;采用塑封和芯片扣密合，体系封闭，减少了产生污染的可能性。所建立的微流控等温扩增荧光检测方法是一种简便、快速、特异、灵敏的检测方法，便于开展呼吸道病毒的现场检测，为呼吸道传染病症候群的病原筛查提供技术支持。

目录

声明

个人简历

摘要

一、前言

1 呼吸道传染病概述

1．1 流感病毒

1．2 呼吸道合胞病毒

1．3 副流感病毒

1．4 腺病毒

2 常规检测方法

2．1 病毒的分离培养鉴定

2．2 免疫学检测方法

2．3 分子生物学检测方法

3 环介导等温扩增技术

3．1 LAMP技术引物

3．2 LAMP技术原理

3．3 LAMP技术研究现状

4．微流控芯片技术

5 主要研究内容与意义

二、常规等温扩增荧光检测技术的建立及评价

1 实验材料

1．1 毒株及分离培养材料

1．2 核酸提取、荧光定量PCR及LAMP扩增实验材料

1．3 实验仪器

2 实验方法

2．1 病原体核酸的提取

2．2 荧光定量PCR方法验证病毒

2．3 相关病毒质粒扩大及提取实验

2．4 LAMP引物设计及筛选

2．5 荧光LAMP反应体系优化

2．6 特异性评价实验

2．7 灵敏度评价

3 结果与讨论

3．1 病原体荧光定量PCR检测

3．2 LAMP引物筛选

3．3 LAMP反应体系优化

3．4 特异性评价

3．5 灵敏度评价

4 小结

三、微流控等温扩增荧光检测技术建立及对呼吸道病毒的检测效果评价

1 实验材料

1．1 微流控荧光LAMP实验材料

1．2 实验仪器

2 实验方法

2．1 微流控等温扩增荧光检测方法的建立及优化

2．2 微流控等温扩增荧光检测特异性评价实验

2．3 微流控等温扩增荧光检测灵敏度评价实验

3 结果与讨论

3．1 微流控等温扩增荧光检测方法体系优化

3．2 微流控等温扩增荧光检测方法的特异性

3．3 微流控等温扩增荧光检测方法的灵敏度

3．4 与荧光定量PCR方法灵敏度的对比结果

4 小结

四、结论

参考文献

附录

综述 等温扩增技术研究进展

致谢

攻读学位期间取得的学术论文