迷迭香酸类似物RA-C1通过依赖Caspase的线粒体通路抑制鼻咽癌CNE-1细胞增殖

摘要

目前，迷迭香酸具备的低毒性和抗肿瘤活性特性已经成为肿瘤治疗的热点化合物之一。然而由于其水溶性较RA-C1肿瘤活性较低限制了其应用，同时由于鼻咽癌的预后不佳，迫切需要新的治疗方法。因此，课题组通过参照迷迭香酸结构，将其酯键用酰胺键取代提高水溶性、羧酸酯化以提高膜渗透性，从而合成了新的迷迭香酸类似物。
　　目的:通过体外实验探讨迷迭香酸类似物RA-C1是否通过激活依赖于Caspase的线粒体通路抑制鼻咽癌CNE-1细胞的增殖，诱导其凋亡，并探索RA-C1的抗肿瘤机制。
　　方法:通过参照迷迭香酸结构式合成了迷迭香酸类似物，命名为(R，E)-3-（3，4-二羟基苯基）-2-（3-（3，4-二羟基苯基）丙烯酰氨基）丙酸甲酯，简称RA-C1。采用MTT法测定RA-C1对鼻咽癌细胞系CNE-1、CNE-2以及HONE-1细胞的选择抑制作用，同时测定其对人体正常的人血管内皮细胞（HUVEC）和人类胚胎肾细胞293（HEK293）的毒副作用。再者进一步拟探讨RA-C1对鼻咽癌CNE-1细胞的抑制的药理学机制。分别采用Hoechst33342染色和Annexin-V FITC/PI双染检测细胞凋亡，随后采用JC-1荧光探针检测线粒体膜电位并采用Western blotting检测细胞色素C、Bax、Bcl-2、Caspase3、Caspase9的表达情况。
　　结果:随着RA-C1的浓度逐渐增大，对CNE-1细胞的增殖抑制率也增大。同时Hoechst33342染色和Annexin-V FITC/PI双染检测细胞凋亡结果显示，随着RA-C1浓度增大，凋亡特征越明显，早期凋亡率越大。此外，随着细胞色素C的释放和Caspase-9和Caspase-3的激活，RA-C1能够使线粒体膜电势的下降，且加入抗氧化剂NAC能够逆转线粒体膜电位的下降趋势。Western blotting结果显示RA-C1能够降低Bcl-2蛋白、升高Bax蛋白的表达。
　　结论:RA-C1有效地抑制鼻咽癌细胞CNE-1细胞的增殖并诱导其凋亡，其机制很可能是通过激活依赖Caspase的线粒体通路促进CNE-1细胞的凋亡。

目录

声明

个人简历

主要英文缩略语

摘要

第一章 前言

第二章 细胞培养相关材料与方法

1．2 实验药物

1．3 主要实验试剂与耗材

2．2 细胞传代

2．3 细胞冻存

第三章 RA-C1对各种细胞株细胞活性作用的实验研究

3．1 材料

3．1．1 细胞株

3．1．2 主要化学试剂和药品

3．1．3 主要实验仪器

3．2 实验方法

3．2．2 Hoechst 33342检测RA-C1对CNE-1细胞的凋亡情况的影响

3．2．3 流式细胞术检测RA-C1对CNE-1细胞的凋亡情况的影响

第四章 RA-C1对鼻咽癌CNE-1细胞信号通路的实验研究

4．1 材料

4．1．1 细胞株

4．1．2 主要化学试剂和药品

4．1．3 实验仪器

4．2 实验方法

4．2．1 JC-1测定CNE-1细胞线粒体膜电位

4．2．2 细胞蛋白的提取

4．2．3 BCA法测蛋白的浓度

4．2．4 Western blot检测与依赖Caspase线粒体通路相关蛋白的表达

4．3 统计学分析方法

第五章 实验结果

5．2 MTT法测定RA-C1对鼻咽癌CNE-1细胞的增殖抑制活性

5．3 Hoechst 33342检测RA-C1对CNE-1细胞形态学的影响

5．4 Annexin-Ⅴ-FITC／PI流式检测CNE-1细胞凋亡

5．5 RA-C1诱导CNE-1细胞线粒体跨膜电位的去极化

5．6 Western blot检测与通路相关蛋白的表达

第六章 讨论

第七章 结论

参考文献

综述 鼻咽癌的系统治疗与鼻咽癌中NF-κB信号通路新发现的研究进展

致谢

攻读学位期间发表的学术论文