STAT3磷酸化调控在不明原因反复流产母胎界面Treg/Th17平衡的作用研究

摘要

本文从以下三部分进行了阐述： 第一部分 不明原因复发性流产患者早孕期母胎界面Treg和Th17细胞及相关细胞因子的变化特点 目的:研究旨在评价不明原因复发性流产(Unexplained recurrentspontaneous abortion，URSA)患者和正常妊娠者母胎界面，信号转导和转录激活子3（signal transducers and activators of transcription3， STAT3）在URSA患者中磷酸化状态的改变情况，并分析这种改变对调节性T细胞（RegulatoryT cell，Treg）/辅助性T细胞17(T helper cell17，Th17)平衡，及相关细胞因子的影响。 方法:收集URSA患者和正常妊娠妇女早孕期的蜕膜组织，流式细胞术分析蜕膜组织中Treg细胞、Th17细胞的比例，并计数CD4+pSTAT3+细胞的数量，酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay，EHSA)检测蜕膜组织中IL-17A、IL-10的含量。 结果:URSA患者蜕膜免疫细胞中Th17细胞比例明显高于正常妊娠组（11.57±1.17％ VS4.37±0.73％，P＜0.001）;URSA组Treg细胞比例低于正常妊娠组(8.45±0.94％ VS13.75±1.49％，P=0.004)。Pearson相关性分析显示，Th17和Treg细胞直接存在负性相关（r=-0.876，P＜0.001）。正常妊娠组的CD4+ pSTAT3+细胞比例显著低于URSA组（36.62±3.03％ VS56.37±4.42％，P=0.018）。Pearson相关性分析显示，CD4+ pSTAT3+细胞和Treg细胞直接存在负相关（r=-0.856，P＜0.001）;与Th17细胞直接存在正相关(r=0.883，P＜0.001)。 结论:本部分的研究描述了母胎界面Treg/Th17细胞对于免疫平衡调节的情况，母胎界面的CD4+T细胞STAT3磷酸化水平异常升高，促进Th17增殖、上调IL-17A分泌，同时抑制Treg细胞的增殖和IL-10的分泌。T细胞的STAT3磷酸化水平与Th17细胞数量、IL-17A浓度呈正相关，与Treg细胞数量、IL-10浓度呈负相关。母胎界面CD4+T细胞STAT3的活化与URSA的发生密切相关。 第二部分 磷酸化STAT3影响不明原因复发性流产患者早孕期母胎界面Treg细胞的功能 目的:通过研究STAT3对URSA患者蜕膜Treg细胞功能的影响，明确STAT3在URSA发病中的作用，为URSA的治疗提供新的思路。 方法:收集URSA患者和正常妊娠妇女早孕期的蜕膜组织，分离出蜕膜免疫细胞，利用磁珠分选的方法分选出Treg细胞和效应T细胞(responderT cells，Tresp)。流式细胞术检测Treg细胞的增殖和抑制功能，并使用STAT3抑制剂V——Stattic改变STAT3的磷酸化情况，观察其对Treg细胞增殖及抑制功能的影响。实时定量荧光PCR(quantitative Real-Time PCR，qRT-PCR)检测Treg细胞中STAT3、STAT5、Foxp3的表达水平。ELISA法检测STAT3磷酸化状态对Treg细胞分泌细胞因子功能的影响。并分别用IL-6、IL-23、IL-17干预Treg细胞，观察各种促炎细胞因子对Treg细胞STAT3磷酸化状态的影响。 结果:URSA患者蜕膜Treg细胞的增殖和抑制功能受损。URSA组Treg细胞的增殖率较正常妊娠组明显下降(76.36±3.99％ VS86.20±2.09％，P＜0.01);URSA组Treg细胞有丝分裂数较正常妊娠组明显降低(4.64×105±7.55×103次VS5.07×105±6.53×103次，P＜0.001)。URSA组Treg细胞的抑制率较正常妊娠组明显降低(3.35±1.43％ VS10.15±1.37％，P＜0.001)。URSA患者蜕膜Treg细胞中pSTAT3+T细胞比例较正常妊娠组明显增加（65.76±5.04％ VS42.4±4.59％，P＜0.001），Stattic能够抑制URSA患者蜕膜Treg细胞STAT3的磷酸化水平，URSA+Stattic组pSTAT3的比例为38.9±4.76％，明显低于URSA组(P＜0.001)。 结论:STAT3的过度磷酸化会损害Treg细胞的功能，在URSA发病过程中起了重要的作用，STAT3的活化抑制了蜕膜Treg细胞的增殖、抑制和细胞因子分泌能力。通过抑制STAT3的磷酸化作用，能够恢复Treg细胞的功能，重建母胎界面的免疫耐受微环境，促进妊娠的建立和维持。 第三部分 醋酸泼尼松调节STAT3磷酸化影响早孕期蜕膜Treg/Th17平衡 目的:本研究通过建立URSA的蜕膜免疫细胞模型，观察和检测DIC中Treg/Th17细胞比例及其相关细胞因子在接受醋酸泼尼松治疗后的改变，以深入研究醋酸泼尼松影响母胎界面Treg/Th17细胞平衡的作用机制。 方法:收集正常妊娠妇女早孕期的蜕膜组织，分离出蜕膜免疫细胞，根据处理的不同将DIC分为四组:①对照组(Control):不加额外的药物及细胞因子，培养72 h;②醋酸泼尼松组(PDN):培养液中添加1μM醋酸泼尼松，培养72 h;③促炎细胞因子组(CTK):培养液中添加10 ng/mlIL-23，20 ng/ml IL-6和5 ng/ml TGF-β1，培养72 h;④醋酸泼尼松+促炎细胞因子组(PDN+CTK):培养液中添加10 ng/ml IL-23，20 ng/ml IL-6和5ng/ml TGF-β1，培养24 h，之后再在培养液中加入1μM醋酸泼尼松，培养48 h。实时定量荧光PCR(quantitative Real-Time PCR，qRT-PCR)检测各处理组中DIC的STAT3、STAT5、RORC、Foxp3 mRNA的表达水平。流式细胞术检测各组DIC中Treg、 Th17和pSTAT3+细胞占CD4+T细胞的比例。ELISA检测DIC培养上清液中IL-10、IL-17A的含量。 结果:醋酸泼尼松能增加Foxp3，STAT5的转录，抑制RORC的转录。PDN组RORC mRNA相对表达量明显低于Control组，差异有统计学意义(P=0.026)。PDN+CTK组的RORC mRNA相对表达量明显低于CTK组(P＜0.01); PDN组Foxp3 mRNA相对表达量明显高于Control组，约为Control组的1.7倍，差异有统计学意义(P＜0.001); PDN+CTK组的Foxp3 mRNA相对表达量约为CTK组的2.1倍; PDN组STAT5 mRNA水平明显高于Control组（P＜0.01），PDN+CTK组STAT5mRNA水平明显高于CTK组p=0.019);四组中STAT3 mRNA水平相当，无统计学差异(P=0.278)。醋酸泼尼松能抑制炎症因子对CD4+T细胞的诱导刺激，抑制DIC向Th17细胞的分化，削弱促炎因子对DIC分化为Treg细胞的抑制作用。PDN组Th17细胞较Control组明显减少(P＜0.001)，PDN+CTK组较CTK组的Th17细胞明显减少(P＜0.001);PDN组Treg细胞较Control组明显增加(P＜0.001)。PDN+CTK组较CTK组的Treg细胞明显增加（P＜0.001）。Control组的CD4+ pSTAT3+细胞比例为57.14±5.19％，显著高于PDN组的16.6±4.25％，P＜0.001;CTK组为75.36±4.27％，PDN+CTK组为35.0±6.01％，比较有统计学差异(P＜0.001)。CTK组与Control组相比，CD4+ pSTAT3+细胞比例明显升高，P＜0.001。Pearson相关性分析显示，CD4+ pSTAT3+细胞和Treg细胞直接存在负性相关(r=-0.956，P＜0.001);和Th17细胞直接存在正性相关（r=0.899，P＜0.001）。PDN组与Control组相比，细胞培养上清液中IL-17的浓度明显降低(P=0.045);PDN+CTK组的IL-17浓度也明显低于CTK组(P=0.045)。PDN组与Control组相比，IL-10的浓度没有统计学差异(P=0.101);PDN+CTK组与CTK组相比，IL-10浓度明显升高(P=0.017)。DIC培养上清液中IL-10的浓度和CD4+ pSTAT3+细胞直接存在负性相关（r=-0.850，P＜0.001）;IL-17A的浓度和CD4+ pSTAT3+细胞直接存在正性相关(r=0.917，P＜0.001)。 结论:泼尼松能够抑制STAT3磷酸化，增加STAT5、Foxp3 mRNA表达，进而促进DIC转化为Treg细胞，抑制其转化为Th17细胞。同时泼尼松还能抑制IL-17A的合成和分泌，并在炎症状态下促进IL-10分泌，以抑制母胎界面免疫排斥反应，促进免疫耐受，重建母胎界面免疫稳态，利于胚胎种植和妊娠的建立与维持。